SNT 1204-2016 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1204—2016代替SN/T1204—2003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法Protocolofthereal-timePCRmethodfordetectinggeneticallymodifiedplantsandtheirderivedproducts2016-06-28发布2017-02-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中华人民共和国出入境检验检疫行业标准植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法SN/T1204—2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址:服务热线:400-168-00102017年10月第一版*书号:155066·2-31325标准号：SN/T1204-2016购买者：烟台富美特食品科技有限公司订单号：0100180131015055防伪号：2018-0131-0351-0278-7444时　间：2018-01-31定　价：32元中国标准在线服务网—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1204—2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》。本标准与SN/T1204—2003相比,主要修改如下:———增加了植物内源基因的检测方法。———增加了转基因植物筛选基因的检测方法。———增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、亚麻、甜菜等作物的品系特异性检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局,深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:黄新、朱水芳、高宏伟、李想、潘良文、陈洪俊、陈枝楠。本标准所代替标准历次版本发布情况为:———SN/T1204—2003。ⅠSN/T1204—2016植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法1范围本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系鉴定实时荧光PCR检测方法。本标准适用于大豆、玉米、油菜籽、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树转基因筛选检测,也适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性实时荧光PCR检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1转基因transgene将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进行表达,以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2实时荧光PCRreal-timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。3.1.3内源基因endogenousgene在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。3.1.4外源基因exogenousgene利用生物工程技术转入的其他生物基因,使该生物品种表现新的生物学性状。1SN/T1204—20163.1.5Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)bp:碱基对(basepair)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)UDG:尿嘧啶DNA-糖基酶(uracilDNAglycosylase)UNG酶:尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate)Taq:DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)TE:Tris-HCl、EDTA缓冲液PE3-PEPcase:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenilpyruvate-Carboxylase)tRNALeu:植物叶绿体基因BARNASE:来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因(ribonucleasegenefromBacillusamyloliquefaciens)BARSTAR:来源于解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特异抑制基因(specificinhibitorofthebarnasegenefromBacillusamyloliquefaciens)BXN:来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的腈水解酶基因(nitrilaseenzymegenefromKlebsiellapneumoniaesubsp.Ozaenae)CryIA(b):苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因(Asyntheticgeneencodesthefirst648aminoacids,insecticidal-activeftruncatedproductidenticaltothatofcryIA(b)geneofBacillusthuringiensissubsp)18srRNA:真核生物18s核糖体RNA基因HMGI/Y:高移动性蛋白家族基因(Highmobilitygroupproteingene)PEP:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(phosphoenolpyruvatecarboxylasegene)CruA:油菜种子储藏蛋白基因(CruciferinAgene)adhl:乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase)zSSIIb:编码玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2的基因(zeinstarchsynthase,granule-boundstarchsynthase)Lectin:植物凝集素基因LAT52:番茄花药(粉)特异性表达基因SPS:蔗糖合成酶(sucrosephosphatesynthase)2SN/T1204—2016PLD:磷脂酶D家族基因(phospholipaseDfamily)GOX:草甘膦氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene)UGPase:尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase(cytoplasmmarker))SAH7:陆地棉的SAH7基因(SAH7proteingeneofGossypiumhirsutum)GLuA3:大米谷蛋白基因(riceGlutelinGene)GAG56:一种醇溶蛋白基因(oneofγ-gliadingenes)Wx012:编码小麦蜡质基因(Waxywheatgenes)Alfalfa-Acc:(苜蓿乙酰辅酶a羧化酶)AlfalfaAcetyl-CoAcarboxylasepCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus)pFMV35S:玄参花叶病毒35S启动子(35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus)tNOS:来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens)NPTⅡ:新霉素-3'-磷酸转移酶基因(neomycin-3-'phosphotransferasegene)BAR:磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(Phosphinothricinacetyltransferasegene)GOX:葡糖氧化酶基因(glucoseoxidasegene)CP4-EPSPS:根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(AgrobacteriumtumefaciensstrainCP4Product:herbicidetolerantformof5-enolpyruvulshikimate-3-phosphatesyn-thase)EPSPS:5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene)Cry3A:抗虫毒蛋白,选择性毒杀科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotatobeetlelarvae)(B.thuring-iensissubsp.Tenebrionis(B.t.t.)strainBI256-82)pNOS:来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(promoterofnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens)pSSuAra:来自拟南芥的小亚基启动子(thesmallsubunitpromoterofArabidopsis)pTA29:来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子(developmentallyregulatedpro-moterfromanther-specificTA29genefromNicotianatabacum)pUbi:玉米泛素基因的启动子(promoterofmaizeUbiquitin)t35S:花椰菜花叶病毒终止子(CauliflowerMosaicVirus35teminator)Te9:为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子tOCS:章鱼碱合成酶终止子(terminatorofoctopinesynthase)tg7:谷氨酰胺转移酶7(Transglutaminase7gene)PMI:6-磷酸甘露糖异构酶基因(Phosphomannose-isomerase)4方法提要提取样品DNA后,采用实时荧光PCR技术对样品DNA筛选基因或品系特异性片段扩增,根据实时荧光扩增曲线,判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测阳性的样品,或已知为转基因阳性的样品,如需进一步进行品系鉴定,则采用品系特异性实时荧光PCR扩增品系特异性片段,根据PCR扩增结果(实时荧光扩增曲线),判定该样品中含有哪(些)种转基因品系成分。3SN/T1204—20165仪器设备5.1实时荧光PCR仪。5.2样品粉碎仪或研磨机。5.3天平:感量0.01g。5.4水浴锅或恒温孵育器。5.5冷冻离心机。5.6高压灭菌锅。5.7涡旋振荡器。5.8生物安全柜。5.9pH计。5.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5