TSATA 011-2019 肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测—实时荧光PCR法

ICS67.050X04团体标准T/SATA011—2019肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测——实时荧光PCR法Real-timePCRDetctionMethodforAnasplatyrhynchosdomesticaandCairinamoschataDNAIngredientsinMeatProduct2019-03-11发布深圳市分析测试协会发布2019-04-11实施T/SATA011—2019I目次前言................................................................................................................................................Ⅱ1范围..................................................................................................................................................12规范性引用文件..............................................................................................................................13原理..................................................................................................................................................14试剂和材料......................................................................................................................................15仪器和设备......................................................................................................................................16分析步骤..........................................................................................................................................27结果判断与表述..............................................................................................................................28防污染措施......................................................................................................................................39方法检出限......................................................................................................................................3附录A（资料性附录）DNA提取试剂盒组成、操作步骤.................................................................4T/SATA011—2019II前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由深圳市分析测试协会归口。本标准主要起草单位：深圳市计量质量检测研究院。本标准主要起草人：林霖、陈国培、吴佳辉、张世伟、王坤、朱成杰、余灏、赖心田、杨国武。本标准为首次发布。T/SATA011—20191食品中家鸭、番鸭DNA成分检测实时荧光PCR法1范围本方法适用于食品中家鸭（Anasplatyrhynchosdomestica）和番鸭（Cairinamoschata）DNA成分的实时荧光PCR检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3原理使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用基于12SrRNA基因设计的家鸭、番鸭通用引物以及特异性探针，通过双重实时荧光PCR反应，分别获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出相应的DNA成分。4试剂和材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.1通用引物序列5’端引物：5’-ACGTACATACCGCCCGTCA-3’3’端引物：5’-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3’4.2特异性探针序列家鸭DNA成分探针：5’-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ1-3’番鸭DNA成分探针：5’-CY5-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ1-3’注：荧光标记基团及淬灭基团可根据所使用的仪器设备调整，应选择无交叉信号的两种荧光基团。4.3商业化DNA提取试剂盒。4.4商业化PCR反应预混液。5仪器和设备T/SATA011—201925.1实时荧光PCR仪。5.2微量紫外分光光度计。5.3恒温水浴锅或恒温混匀仪或金属干浴器。5.4高速冷冻离心机：离心力18,000g以上。5.5样品粉碎机5.6微量移液器（0.5μL-10μL，10μL-100μL，20μL-200μL，100μL-1000μL）。5.7涡旋振荡器。5.8天平：感量0.001g。6分析步骤6.1样品前处理样品经粉样破碎处理后进行DNA提取步骤。6.2DNA提取按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，后每个样品设置两个平行，若有调味料应使用灭菌去离子水洗涤后去除上清液，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。注：试剂盒信息可参考附录A，或使用其他等效试剂盒。6.3DNA浓度测定取1μLDNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。6.4实时荧光PCR扩增实时荧光PCR反应体系见表1。表1实时荧光PCR反应体系PCR预混液（2×）10μL10μmol/L上游引物0.4μL10μmol/L下游引物0.4μL10μmol/L探针（家鸭番鸭探针混合）0.2μLDNA20-50ng灭菌去离子水补充至总体积20μLPCR反应程序：95℃15s；95℃5s，60℃34s（读取荧光），40个循环。6.5实验对照分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。以相应物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含相应物种提取的DNA为阴性对照，以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系为PCR空白对照，以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取为空白提取对照。7结果判断与表述T/SATA011—201937.1质量控制若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；阴性对照：Ct值≥35.0；PCR空白对照：Ct值≥35.0；空白提取对照：Ct值≥35.0；样品平行反应：Ct值经7.2结果判定后应一致。7.2结果判定（1）如Ct值＜30.0，且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种DNA成分。（2）如Ct值≥30.0，且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种DNA成分。7.3结果表述检出XXXDNA成分。未检出XXXDNA成分。8防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。9方法检出限最低检出限可达0.1%（w/w）。T/SATA011—20194附录A（资料性附录）DNA提取试剂盒组成、操作步骤（以Qiagen货号69514的DNeasymericonFoodKit为例）A.1试剂盒组成试剂盒包含试剂和耗材两部分，每个试剂盒可进行50次DNA提取操作。A.1.1试剂组成见表A.1。表A.1试剂名称体积裂解液（FoodLysisBuffer）4x200mL蛋白酶K溶液（ProteinaseK）1.4mL柱结合液（BufferPB）2x30mL漂洗液（BufferAW2）13mL洗脱液（BufferEB）15mLA.1.2耗材组成见表A.2。表A.2耗材名称数量核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns）50个废液收集管（collectiontube）50个A.2试剂盒操作步骤A.2.1在2.0mL的离心管中称取200mg经破碎处理的样品。A.2.2加入1mL裂解液（FoodLysisBuffer），以及2.5μL蛋白酶K溶液（ProteinaseK）。A.2.3置于恒温混匀仪或水浴震荡器中，60℃、1000rpm条件下震荡温育30min。A.2.4冰上冷却至室温15–25C。A.2.52500g离心力离心5min。A.2.6小心避开杂质吸取上清液700μL至含有500μL氯仿至2.0mL离心管中，剧烈混匀15s。A.2.714000g离心力离心15min。T/SATA011—20195A.2.8小心避开杂质吸取上清液350μL至含有350μL柱结合液（BufferPB）至2.0mL离心管中，彻底混匀。A.2.9将核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns）放置到废液收集管（collectiontube）上，将A.2.9中的混合液全部转移至核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns）中，17900g离心力离心1min，丢弃废液收集管（collectiontube）中收集到的废液。A.2.10将核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns）重新放置到废液收集管（collectiontube）上，加入500μL漂洗液（BufferAW2），17900g离心力离心1min，丢弃废液收集管（collectiontube）中收集到的废液。注：漂洗液（BufferAW2）应在使用前按照瓶身标签要求的量加入无水乙醇，并混匀。A.2.1117900g离心力再次离心1min，彻底去除残留液体。A.2.12将核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns）放置到一个新的1.5mL离心管中，加入150μL洗脱液（BufferEB），室温15–25C静置1min，17900g离心力离心1min，丢弃核酸结合柱（QIAquick®SpinColumns），并在1.5mL离心管中获得所提取的DNA。