DB37T 3625-2019 牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程

ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/T3625—2019牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程DifferentialdetectionofBrucellapathogenicorganismsinaerosolofcattleandsheepfarmbyReal-timePCR2019-07-23发布2019-08-23实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3625—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语与定义.........................................................................14缩略语.............................................................................15原理...............................................................................16材料及设备.........................................................................16.1试剂...........................................................................16.2仪器设备.......................................................................27生物安全措施.......................................................................28气溶胶样品的采集、保存及运输.......................................................28.1气溶胶样品的采集...............................................................28.2气溶胶样品的采集后的灭活处理...................................................28.3样品的保存和运输...............................................................29操作方法...........................................................................29.1气溶胶样本的前处理.............................................................29.2核酸提取.......................................................................39.3荧光定量PCR检测...............................................................310分析条件设定和结果判定............................................................310.1阈值设定......................................................................310.2质控..........................................................................310.3结果分析及判定................................................................311注意事项..........................................................................4附录A（资料性附录）主要仪器设备................................................5附录B（规范性附录）牛羊养殖场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项................6附录C（资料性附录）气溶胶布鲁氏菌核酸荧光定量PCR鉴别诊断结果图................8附录D（规范性附录）检测过程防止交叉污染的措施.................................11DB37/T3625—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。本标准主要起草人：何洪彬、赵贵民、王洪梅、侯佩莉、马文青、何成强、程凯慧、杨宏军、张亮、解晓莉。DB37/T3625—20191牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程1范围本标准规定了牛羊养殖场环境气溶胶样本中布鲁氏菌核酸荧光定量PCR鉴别诊断方法。本标准适用牛羊养殖场环境中气溶胶布鲁氏菌核酸的检测以及牛种、羊种和猪种布鲁氏菌核酸的鉴别检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Ct值CycleThreshold荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AGI：全玻璃液体冲击式采样器（All-Glass-Impinger）5原理本标准采用SYBRGreenI染料实时荧光定量PCR技术。布鲁氏菌IS711（InsertionSequence711，IS711）插入序列在不同种的布鲁氏菌基因组中高度保守，仅在拷贝数上存在差异。一条引物锚定在IS711上，另一条引物分别选在不同种布鲁氏菌IS711插入序列邻近的上下游单染色体DNA上，可以用来鉴别布鲁氏菌种的特异性。6材料及设备6.1试剂6.1.1试剂级别DB37/T3625—20192检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。6.1.2引物序列通用型上游引物（Brucella-F）：5’-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3’。通用型下游引物（Brucella-R）：5’-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3’。牛种上游引物（Abortus-F）：5’-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3’。羊种上游引物（Melitensis-F）：5’-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3’。猪种上游引物（Suis-F）：5’-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3’。牛、羊和猪种下游共用IS711-R：5’-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3’。引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成10μmol/L工作液，置于-20℃保存。6.1.3主要组分SYBRGreenI荧光定量PCR反应缓冲液，采用商品化试剂。6.1.4对照设置阳性对照均为疫苗株灭活后提取的核酸样本，有牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA、羊种布鲁氏菌M5疫苗株基因组DNA和猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA，-20℃保存备用。阴性对照为采集自无布鲁氏菌污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组DNA。6.2仪器设备仪器设备及参数见附录A。7生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌核酸，所有检测样本应严格在Ⅱ级生物安全柜内操作。8气溶胶样品的采集、保存及运输8.1气溶胶样品的采集应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。采集方法与注意事项见附录B。8.2气溶胶样品的采集后的灭活处理样品采集后立即用2%石碳酸溶液灭活处理。8.3样品的保存和运输待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；-20℃保存不超过三个月；-80℃以下可长期保存。样品应置于低温（2℃～8℃）、密封的容器内运输。9操作方法9.1气溶胶样本的前处理DB37/T3625—20193取30mL采集的气溶胶样本，12000r/min离心10min，弃上清，重悬沉淀物，继续进行核酸提取，或置-20℃备用。9.2核酸提取采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。9.3荧光定量PCR检测9.3.1反应液的配制采用20μL反应体系，每个反应管包含荧光定量PCR反应液（2×）：10.0μL，上、下游引物各0.8μL，灭菌蒸馏水6.4μL，检测模板与阴、阳性对照分别为2μL。需要配制的荧光定量PCR反应液管数为样品个数n+2（阳性对照）+2（阴性对照）+2（防止分装时液体损失）。按照顺序依次加入上述各荧光定量PCR反应组份的预混液，然后在每个PCR反应管中分装18μL。9.3.2加样在已分装有荧光PCR预混液的PCR反应管中每管分别加入2μL待测样品或对照模板，混匀，盖上管盖，放入荧光PCR仪，记录样品放置顺序。9.3.3荧光定量PCR扩增选择检测模式：SYBRGreenI。反应体系：20μL。反应条件设定：预变性：95℃30s，1个循环；PCR扩增：95℃5s，61℃30s，40个循环，61℃时采集荧光信号。熔解曲线：95℃15s，65℃1min，95℃，Continuous；40℃10s。可根据不同品牌PCR仪器说明书等效设置参数。10分析条件设定和结果判定10.1阈值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线（Baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体需根据仪器噪声情况进行调整，选择PCR扩增反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。10.2质控质控有效的条件为：阴性对照和空白对照应无Ct值或≥35，阳性对照的Ct值应＜35，且呈现S型扩增曲线。10.3结果分析及判定布鲁氏菌核酸阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线、扩增反应曲线无明显对数增长期，判为荧光定量PCR阴性反应，样品判定为布鲁氏菌核酸检测阴性。布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：检测结果呈现Ct值＜35、扩增曲线有明显的对数增长期，且熔解曲线的Tm值为（84.6±0.5）℃：判定为荧光定量PCR结果阳性反应，样品判为布鲁氏菌核酸检测阳性。牛种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：牛种布鲁氏菌检测结果呈现Ct值＜35、且扩增曲线有明显的对数增长期，同时Tm值为：（87.8±0.5）℃。见附录C。羊种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：羊种布鲁氏菌检测结果呈现Ct值＜35、且扩增曲线有明显的对数增长期，同时Tm值为：（86.7±0.5）℃。见附录C。DB37/T3625—20194猪种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：猪种布鲁氏菌检测结果呈现Ct值＜35、且扩增曲线有明显的对数增长期，同时Tm值为：（84.5±0.5）℃。见附录C。11注意事项注意的事项见附录D。DB37/T3625—2019