DB21T 3062-2018 微生物饲料添加剂质量控制技术规范

ICS07.100B46DB21辽宁省地方标准DB21/T3062—2018微生物饲料添加剂质量控制技术规范Technicalspecificationonqualitycontrolofmicrobialfeedadditives2018-10-30发布2018-11-30实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3062—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、高铎、武凤娇、田晓玲。DB21/T3062—20181微生物饲料添加剂质量控制技术规范1范围本标准规定了微生物饲料添加剂及混合型微生物饲料添加剂生产、采样、检验、鉴定、包装、保存、运输过程中的质量控制和技术要求，描述了菌种检验、鉴定及产品性能验证的通用方法。本标准适用于微生物饲料添加剂及混合型微生物饲料添加剂，不适用于转基因微生物饲料添加剂。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB10648饲料标签GB13078饲料卫生标准GB/T23181微生物饲料添加剂通用要求NY/T1444微生物饲料添加剂技术通则JJF1070定量包装商品净含量计量检验规则《中华人民共和国兽药典》《中华人民共和国农业部公告第2045号饲料添加剂品种目录》《伯杰氏细菌系统鉴定手册》《伯杰氏细菌命名手册》3术语和定义3.1微生物饲料添加剂Microbialfeedadditives微生物饲料添加剂是指在饲料中添加或直接饲喂给动物的微生物或微生物及其培养物，参与调节胃肠道内微生态平衡或者刺激特异性或非特异性免疫功能、具有促进动物生长和提高饲料转化效率的微生物制剂。3.2混合型微生物饲料添加剂Mixedmicrobialfeedadditives由一种或一种以上的微生物饲料添加剂与载体或稀释剂按一定比例混合，但不属于添加剂预混合饲料的饲料添加剂产品。3.3目的菌Targetmicroorganisms系指直接用于生产的菌种。3.4种子批Seedlot系指特定菌株的贮存物，通常包括原始种子、主种子批和工作种子批，建立种子批系统旨在保证原粉生产的一致性。DB21/T3062—201823.5原始种子Primaryseed系指细菌分离株经适应性培养、传代后，经生物学特性、免疫原性和遗传稳定性等特性研究鉴定，可用于微生物饲料添加剂生产的种子。原始种子用于主种子批的制备。3.6主种子Mainseed系由原始种子传代扩增至特定代次，并经一次制备获得的同质和均一的悬液或干粉分装于容器制备而成。主种子用于制备工作种子。3.7工作种子Workingseed系由主种子传代扩增至特定代次，并经一次制备获得的同质和均一的悬液分装于容器制备而成。4生产要求微生物活菌的制备方法、工艺应能保证其成品含有足够的活菌数量，并在有效期内保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。4.1生产用菌种4.1.1名称及来源生产用菌种应来自动物体内和人体的正常菌群;或对动物体及人体无毒无害、具有促进正常菌群生长和活性作用的外籍细菌。细菌的分离过程和传代背景应清晰，应具备稳定的生物学和遗传学特性，并能保持稳定的活菌状态，经实验室和临床试验证明安全、有效。并获得具有资质的微生物鉴定机构出具的菌种鉴定报告。4.1.2种子批的建立种子批分为三级，分别为原始种子、主种子和工作种子。4.1.3种子批的检定菌种的属、种型分类鉴定，应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册（Bergey＇sManualofSystematicBacteriology）和伯杰氏细菌命名手册（Bergey＇sManualofDeterminativeBacteriology）的有关规定进行，包括形态、生长代谢特性检查。4.1.3.1培养特性将菌种接种于特异性培养基，置有氧或厌氧环境中培养，观察其生长情况，确定菌种的好氧条件；以划线法观察在琼脂平皿上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征；也可观察菌种在不同温度、pH值或不同浓度的氯化钠溶液等条件下的生长特性等。4.1.3.2染色镜检取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等，有芽孢的细菌应同时观察芽孢的形状、大小和位置（也可增做芽孢染色）。检查结果均应符合原始菌种的特性。4.1.3.3生化反应按特异的方法进行，应包括目的菌的关键生化反应，结果应符合原始菌种的特性。4.1.3.4遗传特性分析采用16SrRNA序列测定，应符合原始菌种的遗传特性。DB21/T3062—201834.1.3.5种子批的保存原始种子和主种子应冻干保存于4℃或-20℃，工作种子应置于2℃～8℃保存。种子批传代应限定传代次数，原始种子批和主种子批启开后传代次数不得超过10代，工作种子批启开后至发酵培养传代次数不得超过5代。4.1.3.6安全性评价实验4.1.3.6.1毒性试验可选用靶标动物进行试验或采用常规方法进行。常规方法:用体重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3mL新鲜菌液，连续观察3天，小鼠均应健康存活；或每只小鼠经口灌胃0.5mL新鲜菌液，每天1次，连续3天，从第1天至第7天连续观察，小鼠均应健康存活。注：新鲜菌液浓度为不少于推荐常规菌种使用时浓度。4.1.3.6.2抗生素敏感性试验采用琼脂扩散纸片法或微量稀释法进行菌株的抗生素敏感性检查，应符合原始菌种的特性。4.1.3.6.3稳定性试验.菌种在特异性培养基中，连续传代30代次后，将第30代培养物做种子批检查、鉴定，全部结果应与原始菌种的特性一致。4.1.3.6.4选择性特性试验应根据原始菌种的特性进行耐热性、耐酸性、耐碱性、耐胆盐等相关特性考察。4.1.4菌种保藏与管理4.1.4.1管理制度建立菌种管理制度，对菌种实行全流程管理。对菌种的保管应有专人负责，单独保藏，实行双人双锁管理。应有程序和措施以保证菌种的安全，防止污染、丢失或损坏。4.1.4.2菌种档案应建立菌种档案，涵盖来源、鉴定、特性、保存、传代、使用等信息，确保溯源性和稳定性。菌种信息应完整、准确、清晰的标识于菌种保藏管。4.2菌粉制备应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体（或芽孢）和菌体干燥制成菌粉等。4.2.1生产用种子使用主种子批菌种，接种于特异性培养基进行多级种子扩增，应涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察5～10个视野，细菌的染色反应、形态应一致并符合原始菌种的特征。制备过程应防止污染，菌种传代次数应符合规定。4.2.2生产车间或实验间生产车间或实验间符合相应实验室无菌级别要求。生产设备和管路应经过严格灭菌，灭菌后检测合格方可使用，避免交叉污染。4.2.3培养基采用经批准的培养基用于生产，培养基应经过高压蒸汽灭菌。4.2.4培养DB21/T3062—20184采用液体培养。将种子液置于特异性条件下培养（包括厌氧或需氧、温度、时间等），培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检、pH值检测等，芽孢菌需要进行芽孢形成率的检测，均应符合该菌种的规定。培养结束后，取样做纯菌检查，如发现污染应予废弃。4.2.5收获菌体液体菌培养结束后直接分装收获。菌粉培养结束后采用分离技术收获湿菌体，与分散剂、稳定剂混合后制成干粉。4.3微生物饲料添加剂同一工作种子批菌种生产的最多2批单一菌粉，可按批准的比例与辅料混合均匀后制成微生物饲料添加剂，配制过程应防止污染。微生物饲料添加剂浓度为每千克全价料中不低于106cfu。4.4混合型微生物饲料添加剂混合型微生物饲料添加剂包括固态型、液态型和半固态型。4.4.1菌体组成要求生产混合型微生物饲料添加剂时，应每种菌分别培养制备单一菌粉。混合型微生物饲料添加剂应选择附录A.1中所列菌种，且菌种数目不宜超过5种。使用一种以上菌时，不同菌之间应通过协同关系试验。4.4.2分批同一批号，原料应来源一致、质量均一，按规定要求抽样检验后，能对整批产品作出评定。5采样要求5.1采样原则采集的样品要具有代表性，能反映被采样本的总体水平，且避免引入外来污染。5.2采样人员采样应由受过相应培训的人员进行，采样人员应具备对微生物生物危害及防止交叉污染的常识，采样时应采取佩戴口罩、手套等措施保证自身安全及避免外来污染。5.3采样工具采样工具和取样容器要达到无菌的要求。5.4采样数量采样数量可结合检验需要量，应考虑到样品分布的均一性。5.5采样过程采样应与样品存在环境一致，对于有完整包装的样品，尽可能整件抽取，减少操作过程，避免污染。对于无完整包装或需要打开包装抽取的样品，要求无菌取样。应对样品信息进行及时、准确的记录和标记。DB21/T3062—201856检定要求6.1微生物饲料添加剂检定6.1.1感官要求应包括颜色、气味和有无霉变。6.1.2目的菌检查取菌粉加人灭菌生理盐水或其他专属稀释液稀释至1×103cfu/mL，接种在特异性琼脂平皿上，每个菌种的培养特性、染色镜检和生化反应检查，应符合该菌种特征。6.1.3活菌数测定测定每克或每毫升菌粉中含有的活菌数量。活菌数测定方法按照《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物检验》、《饲料添加剂饲用活性干酵母（酿酒酵母）》、《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》等方法执行，详见附录A.2。6.1.4杂菌检查方法和结果判断按NY/T1444执行，如不符合规定应废弃。6.1.5卫生指标测定常规指标方法按表1执行。表1微生物添加剂卫生指标要求项目指标试验方法黄曲霉素B1，μg/kg≤10.0GB/T17480砷（以总砷计）的允许量，mg/kg≤2.0GB/T13079铅（以Pb计）的允许量，mg/kg≤5.0GB/T13080汞（以Hg计）的允许量，mg/kg≤0.1GB/T13081镉（以Cd计）的允许量，mg/kg≤0.5GB/T13082大肠菌群的允许量，个/kg≤1.0×105GB4789.3霉菌总数的允许量，个/kg≤2.0×107GB/T13092沙门氏菌的允许量不得检出GB/T13091致病菌（肠道致病菌及致病性球菌）不得检出GB4789.3、GB4789.5和GB4789.106.2混合型微生物饲料添加剂检定6.2.1感官要求应包括颜色、气味和有无霉变。6.2.2目的菌检查检査成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“4.1.3”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。对于混合型饲料添加剂，则须逐一检查单一菌特性。DB21/T3062—201866.2.3活菌数测定测定每克或每毫升产品中的活菌数，混合型饲料添加剂应分别测定各单一活菌数。测定方法按上述“6.1.3”执行。6.2.4杂菌检查方法和结果判断按NY/T1444执行。6.2.5卫生指标测定常规指标方法按6.1.5执行。6.2.6净含量按JJF1070执行。7标签、规格和包装7.1标签标签按GB10648执行，同时标识活菌数的下限、杂菌数的上限。7.2包装应符合GB/T23181的有关规定，包装材料应无毒无菌，内包装物采用符合卫生标准的材料，对产品无抑制性。8运输和贮存8.1运输产品在运输过程中应避免暴晒、雨淋和受热，不得与有毒有害物品混装混运。8.2贮存产品应贮存于阴凉、通风、干燥处，防止暴晒、雨淋和受热，如有特殊要求应注明。9保质期自生产之日起，按批准的有效期执行。DB21/T3062—20187AA附录A（规范性附录）饲料添加剂微生物品种目录表A.1饲料添加剂微生物品种目录类别通用名称适用范围微生物地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种（原名：乳酸乳杆菌）、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢