GB∕T 39512-2020 磷酸化标记核酸检测通则

书书书犐犆犛０７．０８０犃４０中华人民共和国国家标准犌犅／犜３９５１２—２０２０磷酸化标记核酸检测通则犘狉犻狀犮犻狆犾犲犳狅狉狆犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犾犪犫犲犾犲犱狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狋犲狊狋犻狀犵２０２０１１１９发布２０２１０６０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ３８７）提出并归口。本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、通用生物系统（安徽）有限公司、四川省亚中基因科技有限责任公司、深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、成都先导药业开发股份有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、四川大学华西医院、四川农业大学、河北医科大学。本标准主要起草人：周李华、雍金贵、韩国全、刘宗文、杨杰斌、潘红、李怀平、张懿、马丽侠、杨国武、刘倩、蒋子敬、杨丽、郝军政、郑燕燕、吕品。Ⅰ犌犅／犜３９５１２—２０２０磷酸化标记核酸检测通则１　范围本标准规定了磷酸化标记核酸检测的术语和定义、缩略语、一般要求、测定方法、样品保存和报告。本标准适用于ＤＮＡ编码化合物文库构建用的磷酸化标记核酸的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ３０９８８　多酚类植物基因组ＤＮＡ提取纯化及测试方法ＧＢ／Ｔ３０９８９　高通量基因测序技术规程ＧＢ／Ｔ３４７９７　核酸引物探针质量技术要求３　术语和定义ＧＢ／Ｔ３４７９７界定的以及下列术语和定义适用于本文件。３．１磷酸化标记核酸　狆犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犾犪犫犲犾犲犱狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱５′端标记一个磷酸基团，长度范围在９ｎｔ～１７ｎｔ的单链ＤＮＡ。３．２犇犖犃编码化合物　犇犖犃犲狀犮狅犱犲犱犮狅犿狆狅狌狀犱具有５′端标记磷酸基团，３′端带有２～６个碱基黏末端，９ｎｔ～１７ｎｔ的两条单链ＤＮＡ退火形成的双链。３．３退火　犪狀狀犲犪犾犻狀犵两条单链ＤＮＡ通过加热变性、降温复性的方式，依据碱基互补配对原则结合在一起。３．４互补链　犮狅犿狆犾犲犿犲狀狋犪狉狔狊狋狉犪狀犱通过碱基互补配对形成的双链核苷酸链中的两条单链。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＩＥＡ：犖，犖二异丙基乙胺（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（ＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ）１犌犅／犜３９５１２—２０２０ＨＦＩＰＡ：六氟异丙醇（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）ＨＰＬＣ：高效液相色谱（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ＬＣＭＳ：液相色谱质谱联用仪（ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）ＯＤ：光密度（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ）ＴＥＡＡ：三乙基铵醋酸盐（ＴｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＡｃｅｔａｔｅ）５　磷酸化标记核酸检测一般要求５．１　样品要求检测样品应为无色或浅黄色澄清液体，无悬浮物，无机械杂质。样品管保存完好，无破损、无漏液。５．２　人员要求进行磷酸化标记核酸检测的人员应具有生物、化学专业知识的教育背景。５．３　试剂要求除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯试剂，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．４　检测项目磷酸化标记核酸的检测项目参见表１，指标参数的参考结果参见附录Ａ。表１　磷酸化标记核酸检测指标及测定仪器样品指标项目测定方法仪器设备磷酸化标记核酸总量６．１紫外分光光度计相对分子质量６．２ＬＣＭＳ碱基准确度６．３．２ＬＣＭＳ６．３．３测序仪纯度紫外吸收强度６．４．１紫外分光光度计ＨＰＬＣ纯度６．４．２ＨＰＬＣ仪质谱纯度６．４．３ＬＣＭＳ碱基缺失率完全匹配度６．５．２测序仪碱基缺失率６．５．１ＬＣＭＳ互补链浓度差紫外吸收强度６．６．１紫外分光光度计质谱峰强度比６．６．２ＬＣＭＳ化合物间浓度差６．６．３紫外分光光度计脱磷酸化产物脱磷酸产物占比６．７ＬＣＭＳ连接效率原料胶图转化率／相对分子质量６．８凝胶电泳仪／ＬＣＭＳ２犌犅／犜３９５１２—２０２０６　测定方法６．１　总量检测按照ＧＢ／Ｔ３４７９７执行。６．２　相对分子质量检测６．２．１　直接计算相对分子质量可依据定制序列，按照式（１）直接计算：ＭＷ＝（犃×３１３．２１）＋（犆×２８９．１８）＋（犌×３２９．２１）＋（犜×３０４．２）＋７９．９８－６１．９４…………（１）　　式中：ＭＷ　　———相对分子质量；犃，犆，犌，犜———各碱基相对应的碱基数；７９．９８———５′磷酸基团相对分子质量；６１．９４———磷酸二酯键残基相对分子质量。６．２．２　质谱检测采用ＬＣＭＳ对磷酸化标记核酸的相对分子质量（ＭＷ）进行检测，ＬＣＭＳ通过电喷雾电离源将样品转化为运动的带电气态离子碎片，然后按质荷比（犿／狕）大小分离并记录，通过质谱分析软件换算出目标化合物的相对分子质量。仪器运行前检查确认仪器的离子源、检测器、数据系统等状态正常，ＬＣＭＳ的设备参数及流动相参数参考附录Ｂ中的Ｂ．１。６．２．３　测定结果采用６．２．２方法测得的相对分子质量（ＭＷ）与６．２．１中计算的相对分子质量（ＭＷ）进行比较得出相对误差。６．３　碱基准确度检测６．３．１　总则磷酸化标记核酸序列和定制序列的匹配程度，由合成仪自动生成的序列信息与质谱检测、测序检测的结果进行比对验证。６．３．２　液相色谱质谱法采用６．２．２方法测定，将测得的相对分子质量与６．２．１中定制序列的理论相对分子质量（ＭＷ）进行比对验证。６．３．３　基因测序法按照ＧＢ／Ｔ３０９８９执行，对磷酸化标记核酸进行序列测定。６．４　纯度检测６．４．１　紫外分光光度法按照ＧＢ／Ｔ３０９８８执行。３犌犅／犜３９５１２—２０２０６．４．２　高效液相色谱法采用ＨＰＬＣ仪对磷酸化标记核酸的纯度进行测定，设备运行参数参考Ｂ．２。确保仪器状态正常后，取１０μＬ５０μｍｏｌ／Ｌ磷酸化标记核酸溶液和２０μＬ超纯水置于进样瓶中混匀，点击仪器运行按钮，仪器自动进样检测。根据检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值，得出磷酸化标记核酸的纯度。６．４．３　液相色谱质谱法采用６．２．２方法测定，计算目标峰质谱信号的强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出磷酸化标记核酸的质谱纯度。６．５　碱基缺失率检测６．５．１　液相色谱质谱法采用６．２．２方法测定，计算缺碱基峰的质谱信号强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出碱基缺失率。６．５．２　基因测序法采用６．３．３方法测定，计算碱基缺失信号比例。６．６　互补链浓度差检测６．６．１　紫外吸收强度检测６．６．１．１　单链浓度检测采用紫外分光光度法对磷酸化标记核酸进行紫外吸收强度检测，测得核酸在２６０ｎｍ处的吸收强度即ＯＤ２６０数值，测得的ＯＤ２６０数值乘以稀释倍数作为最终定量的ＯＤ２６０数值，用ＯＤ２６０数值除以消光系数转换为样品浓度。６．６．１．２　互补链浓度差根据单链定量结果，计算两条互补链间的浓度差。　　注：检测前离心并混匀样本，样本量大时，可采用摇床６００ｒ／ｍｉｎ，２５℃，１０ｍｉｎ混匀。６．６．２　质谱峰强度比检测采用６．２．２方法测定，计算双链中含量较低的单链质谱信号强度占双链总质谱信号强度的比值。６．６．３　化合物间浓度差检测采用紫外分光光度法对互补链退火后形成的磷酸化标记核酸双链进行紫外吸收强度测定，将检测的质量浓度除以互补链混合产物的相对分子质量得出摩尔浓度，最终计算不同的磷酸化标记核酸双链间的摩尔浓度差即化合物间浓度差。６．７　脱磷酸化产物检测采用６．２．２方法测定，计算未标记上磷酸基团的产物峰（其相对分子质量比目标相对分子质量低７９．９８）的质谱信号强度占所有质谱峰信号强度的比值，得出脱磷酸率。４犌犅／犜３９５１２—２０２０６．８　连接效率检测６．８．１　样品准备采用凝胶电泳法测定连接效率，向５μＬ１ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸化标记核酸原液中加入６．５μＬ１ｍｍｏｌ／Ｌ的质检底物、２μＬ１０×连接缓冲液和２．５μｇＴ４ＤＮＡ连接酶，定容至２０μＬ后混匀制备反应液。将配制的反应液置于２０℃下反应４ｈ，反应后取２μＬ反应液稀释２５倍后待用。６．８．２　连接效率检测反应液进行琼脂糖凝胶电泳；电泳结果采用灰度定量法进行连接效率计算，其中连接效率＝连接产物灰度值／（连接产物灰度值＋剩余原料灰度值）。７　样品保存贮存于－２０℃冰箱，避免反复冻融。未稀释的干粉－２０℃保存不宜超过１年；稀释后的样品－２０℃不宜超过半年。８　报告磷酸化标记核酸合成后应附合成报告单或等同的指导性文件。文件内容应至少包括以下部分：ａ）　名称；ｂ）　序列；ｃ）　长度；ｄ）　纯化方式；ｅ）　摩尔量；ｆ）　相对分子质量；ｇ）　浓度；ｈ）　保存条件和有效期。５犌犅／犜３９５１２—２０２０附　录　犃（资料性附录）磷酸化标记核酸检测指标项目及参考结果　　磷酸化标记核酸检测的各指标项目和参考结果参见表Ａ．１。表犃．１　磷酸化标记核酸检测指标及参考结果样品指标项目参考结果磷酸化标记核酸总量偏差≤±１５％相对分子质量偏差≤０．０５％碱基准确度偏差≤０．０５％与定制序列一致纯度紫外吸收强度ＯＤ２６０／ＯＤ２８０：１．７～１．９ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞１．７色谱纯度≥８５％质谱纯度≥８５％碱基缺失率完全匹配度＜５％碱基缺失率＜５％互补链浓度差紫外吸收强度偏差＜±１５％质谱峰强度比＞２０％化合物间浓度差偏差≤２５％脱磷酸化产物脱磷酸产物占比＜５％连接效率原料胶图转化率／相对分子质量＞９０％６犌犅／犜３９５１２—２０２０附　录　犅（资料性附录）犔犆犕犛和犎犘犔犆的设备及条件犅．１　液相色谱质谱法液相色谱质谱法流动相配制以及检测条件如下：ａ）　液相色谱质谱法流动相配制参见表Ｂ．１；ｂ）质谱条件：电喷雾电离源，离子阱质量分析器；ｃ）毛细管电压：４０００Ｖ；ｄ）雾化气压力：０．２８ＭＰａ；ｅ）雾化气温度：３５０℃；ｆ）破裂电压：１５０Ｖ；ｇ）雾化气：氦气；ｈ）色谱柱：Ｃ１８Ｃｏｌｕｍｎ，１３０?，２．５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ；ｉ）柱温：４０℃；ｊ）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；ｋ）梯度洗脱条件参见表Ｂ．２。表犅．１　流动相犃、流动相犅配制流动相Ａ（以１Ｌ计算）０．０７５％ＨＦＩＰＡ（７５０μＬ）０．０３７５％ＤＩＥＡ（３７５μＬ）１０μｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１０ｍＬ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１００％Ｈ２Ｏ（９９０ｍＬＨ２Ｏ）流动相Ｂ（以１Ｌ计算）０．０７５％ＨＦＩＰＡ（７５０μＬ）０．０３７５％ＤＩＥＡ（３７５μＬ）１０μｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１０ｍＬ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ８０％ＡＣＮ，２０％Ｈ２Ｏ（８００ｍＬＡＣＮ，１９０ｍＬＨ２Ｏ）表犅．２　梯度洗脱条件（液相色谱质谱法）时间ｍｉｎ流动相Ａ体积分数％流动相Ｂ体积分数％０９５５６９５５１２５５４５２５５５４５２６９５５３５９５５犅．２　高效液相色谱法高效液相色谱的检测条件如下：犌犅／犜３９５１２—２０２０书书书犌犅／犜３９５１２—２０２０　　ａ）　色谱柱：Ｃ１８Ｃｏｌｕｍｎ，１３０?，２．５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ；ｂ）流动相Ａ：０．１ｍｏｌ／ＬＴＥＡＡ；流动相Ｂ：乙腈；ｃ）柱温：６０℃；ｄ）检测器：紫外检测器；ｅ）检测波长：２６０ｎｍ；ｆ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｇ）梯度洗脱条件参见表Ｂ．３。表犅．３　梯度洗脱条件（高效液相色谱法）时间ｍｉｎ流动相Ａ体积分数％流动相Ｂ体积分数％０９５５１０９０１０１０．５７０３０１１．５７０３０１２９５５１５９５５０２０２—２１５９３犜／犅犌版权专有　侵权必究书号：１５５０６６·１６６５８９定价：　　１６．００元