用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段.

◇实验方法学◇用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段3汪思应郑红程洁余科科许望翔1李俊23(安徽医科大学病理生理学教研室、2临床药理研究所,合肥230032摘要目的建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。方法应用PCR原理,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(300bp±作为探针,对PCR产物进行Sorthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度;回收“目的基因”片段并连接入PGEM2T载体,转染JM109并扩增后,提取“目的基因”测序。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段,Sorthern杂交发现一段长度为115kb的cDNA片段为“目的基因”;测序结果与GeneBank进行Blaste分析,该基因为一株新的序列,已在GeneBank中登录注册(RatLiverRegeneration2relatedPro2tein1,RLRP21AF236054。结论应用PCR结合Sorthern杂交等手段可迅速从cDNA文库中获取长片段目的基因。关键词基因;实验方法;PCR随着分子生物学研究的发展,人们已建立了多种方法来获取“目的基因”。但传统的菌落杂交筛库技术操作繁琐、耗时长且可靠性不高[1];多种获取cDNA的试剂盒价格昂贵且有时需特殊仪器,因此我室利用简单的PCR技术从cDNA文3国家自然科学基金(39670366及安徽省自然科学基金(000442021军事医学科学院,北京1008503通讯作者库中获取“目的基因”大片段。并用已知小片段目的基因作为探针来鉴定PCR产物以确保实验结果的正确。现报道如下。1材料与方法1.1材料Wistar大鼠购自军事医学科学院动物中心;大鼠胎肝cDNA文库购自Clonetech公司;探针标记试剂盒购自Promega公司;α232P(dCTP购自北京亚辉放射生物公司;PCR试剂购自宝生物(大连公司。1.2目的基因小片段的获取用RDA(表达性差异显示分析,representationaldifferenceanalysis,RDA技术筛选正常大鼠肝与再生肝差异表达基因并建立差显EST文库,随机挑选53个重组子测序并用DNAtools,BLAST等软件进行生物学信息分析。其中有10个序列在Genebank中无明显同源性发现。再用SlotBlotting,NorthernBlotting验证,获得了几个与肝再生可能相关的新的小片段基因(300~500bp[2]。1.3PCR设计根据已知小片段基因序列设计正反向引物,并与cDNA文库中载体引物T7/SP6分别配对。以大鼠胎肝cDNA文库为模板进行PCR,PCR产物经琼脂糖凝胶分析,凝胶成像仪扫描成像。目的基因PCR引物:P15′2AGTGCTATTGTGACCATCAAGATG23′P25′2TTCTGGTCACTCCACATCAGCTCT23′文库载体插入片段两端引物:T75′2ATTATGCTGAGTGATATCCC23′SP65′2TAAATCCACTGTGATATCTT23′胆囊切除、瘘口直接修补、T管引流术:本组Ⅱ型10例,瘘口较小(肝总管周径1/3,逆行切除胆囊,肝总管瘘口用3~0无损伤缝线直接缝合关闭,瘘口处有较厚瘢痕时应予修理再缝,于瘘口下方置T管引流3~6mon不等,无并发症发生。注意T管不能放置在瘘口内,否则,易发生晚期的胆道狭窄。遇胆囊萎缩,宜剖开胆囊,吸净胆汁,取出结石,用细小号探子,探明胆道做到心中有数,以左手食指衬在胆囊内,紧贴胆囊剥离切除胆囊。发生胆瘘1例,持续负压引流痊愈。胆囊切除+胆囊壁补片修补+T管引流术:3例Ⅲ型患者,采用此术式,1例术后发生胆漏,保守治疗痊愈。利用胆囊壁补片修补瘘口,其优点是组织结构相似,要保证补片有良好的血供,缝合要保证无张力和缝合严密,T形管要在瘘口下方的胆总管上另开口置入,短臂超过胆囊胆管瘘,置管3~6mon。如果术中估计不足未留胆囊瓣,可以用肝圆韧带或带血管蒂的空肠片修补。对Mirizzi综合征Ⅳ型者或肝总管损害大于1/2的,直接缝合和补片修补会引起胆管狭窄,应行空肠肝管Roux2Y吻合。Mirizzi综合征一般视为腹腔镜胆囊切除术的禁忌证,近两年,随着腹腔镜手术技术水平不断提高,也可见Mirizzi综合征经腹腔镜胆囊切除术的报道〔4〕。参考文献1CsendesA,CarlosJ,BurdilesPetal.Mirizzisyndromeandchole2cystobiliaryfistula:Aunifyingclassification.ByJSurg,1989;76(11:11392沈世鹏,萧蓉葆编著.胆石病.第1版,北京:人民卫生出版社,2000;1:106~93McsherryCK,FerstenbergH,VirshupM.TheMirizzisyndrome:SuggestedclassificationandSurgicaltherapy.SurgGastroenterol,1982;1:2194李际辉,郑成竹,仇明etal.Mirizzi综合征的腹腔镜治疗.中国实用外科杂志,2000;20(12:727~8・85・安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2003Feb;7(1实验原理示意图:1.4同位素探针标记详见Promega公司探针标记试剂盒说明书:取小片段“目的基因”(cDNA150ng,加无核酸酶水至15μl,100℃变性5min,立即置冰,分别加入Promega探针标记试剂:5XLabelingbuffer5μl、BSA1μl、dNTPmix1μl、32p2dCTP215μl、TαKαRαKenownⅠ015μl。室温(25℃反应1h,用SephdexG250柱纯化后,-20℃储存备用。1.5Sorthern杂交PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并扫描成像后,按照《分子克隆》介绍[1],将凝胶浸泡在变性液中摇晃变性1h,中和液中和20min。转NC膜(约15h,将NC膜80℃干烤2h,用BioDev公司杂交液在杂交炉中65℃予杂交1h,加入碱变性的同位素探针,65℃杂交过夜。NC膜用2×SSC、015×SDS液室温洗2遍,015×SSC、015×SDS液50℃洗2遍,每遍20min。压片,根据膜的放射性强度,-70℃暴光数小时。1.6“目的基因”回收、连接将Sorthern杂交结果与相应的凝胶成像结果比较,确定“目的基因”大片段的长度,从电泳凝胶上目的基因相应位置切下凝胶,用BioDev公司玻璃奶DNA回收试剂盒回收“目的基因”(详见BioDev公司DNA回收试剂盒说明书并定量,将目的基因连接入PGEM2T载体,感染JM109宿主菌,酶切鉴定阳性重组子。1.7目的基因扩增、测序将阳性重组子扩增,用Promega公司质粒提取试剂盒(详见试剂盒说明书提取质粒,以PE公司自动测序仪测定阳性重组子序列,并以BLAST与GeneBank序列(包括expressedsequencetags,EST序列库进行同源性比较。2结果2.1PCR扩增用根据小片段目的基因设计的引物,分别与大鼠胎肝cDNA文库载体引物配对,用大鼠胎肝cDNA文库为模板,进行PCR扩增。PCR产物经110%琼脂糖凝胶电泳分析并凝胶成像后发现,用P1+T7引物进行的PCR在014kb处有阳性扩增;用P2+SP6引物进行的PCR在115、016kb处均有阳性扩增;而用P2+T7,P1+SP6引物进行的PCR未见阳性扩增。2.2Sorthern杂交鉴定目的基因将PCR产物用110%琼脂糖凝胶电泳分析并凝胶成像后,用小片段“目的基因”为模板标记的同位素探针进行Sorthern杂交,杂交结果与凝胶成像对比分析后发现:在P2+SP6配对引物PCR产物中,应该图1PCR扩增结果M:DL2000Maker,A:P2+T7,B:P2+SP6,C:P1+SP6,D:P1+T7,E:P1+P2图2Sorthern杂交结果有两条长度约为115kb、016kb阳性扩增带。2.3目的基因序列将阳性扩增带回收后连接入PGEM2T载体,转化宿主菌并扩增,重提质粒进行酶切鉴定,并用PE公司自动测序仪以T7/SP6引物进行序列分析。结果发现阳性扩增序列中包含用目的基因小片段,进一步证实为目的基因长片段。经BLAST与GeneBank对比无同源性发现,为一新序列,我们命名为肝再生相关基因21(RLRP21。GeneBank登录注册号为:AF236054。3讨论基因的选择性表达是很多生理和病理现象的基本调控方式之一[3]。药物反应的基本机制也与相关的基因表达有关[4]。发现和掌握新的未知功能基因的信息仍是目前分子病理、分子药理的研究热点。很多分离功能基因的实验技术如RDA、基因芯片(Microarray、筛选分子展示文库等被广泛应用[5~7]。但这些技术所分离到的功能基因往往是EST序列即小片段,其所载的信息量少,无明显的开放读框(ORF,不能较明确地发现其功能结构域。且对功能基因的研究也要求获取其全长cDNA序列。因此如何根据小分子EST序列的信息来发现更长甚至全长的基因序列仍是研究比较为难的事。很多生物公司推出相关技术并配套试剂盒如5’2RACE技术及试剂,Clonetech公司的PositivecDNAClonecaptureKit等均是用来发现更长甚至全长cDNA序列。其优点是所需的序列信息少;耗时少;但价格昂贵且技术手段要求高。基于以上情况,我们建立一种快速PCR结合Sorthern杂交技术,从特定cDNA文库中获取长片段cDNA。对照其它方法,该方法具有耗时短,耗费少,简便易行等优点,在条件一般的实验室均能应用。由于PCR反应存在非特异扩增,我们强烈推荐使用高宝真Taq(AdvantageDNAPloymerase并结合Sorthern杂交以提高CDNA序列的精确性及目的基因的正确性。另外还可增加PCR引物长度以提高退火温度来增加PCR扩增反应特异性。・95・安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2003Feb;7(1参考文献1J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.著.分子克隆实验指南,北京:科学出版社,1999:60~752Xuwangxiang,Wangsiying,Wanggeetal.IdentificationandCharacterizationofdifferentillyExpressedGenesintheearlyResponsePhaseduringtheLiverRegeneration.BiochemandBiophysResComm,2000;278(2:318~253TapperoG,FarinaM,NegroFetal.Intrahepaticexpressionofc2fos,c2mybandc2myconcogenes:correlationwithvirus2inducedchronicliverdiseaseandresponsetointerferon.ItalJGastroenterolHepatol,1997;29(2:148~544YeeKW,O’FarrellAM,SmolichBDetal.SU5416andSU5614inhibitkinaseactivityofwild2typeandmutantFLT3receptortyrosinekinase.Blood,2002;15(8:2941~95汪思应,卢海妹,郑红etal.用差异显示杂交技术筛选与造血相关的新基因.安徽医科大学学报,2000;35(6:422~46SchenaM,RenuA.Microarrys:biotechnologydiscoreryplatformforfunctionalgenomics.Tib,1998:16~227UrbanelliL,RonchiniC,FontanaLetal.Target