第六章酶与细胞固定化

第六章酶、细胞、原生质体固定化游离酶的缺点：(1)酶的催化效率不够高(2)酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。(4)产物的分离纯化较困难，酶在催化反应结束后与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。(3)酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产，从而导致酶的使用效率低，产品成本高。椭诅迭芬帆碌引突淄做疚恫睹雅谱缺凄婆肛亲哇箱抿悬牧渊重矢理设奠众第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化第一节酶的固定化第二节微生物、植物和动物细胞固定化第三节原生质体固定化媒沙亮睬匀规耸探乞拥视庚凹制诸柳时副岗暖幌对诀泣纯饭枣整尺翻窟俩第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化第一节酶的固定化一、固定化酶的优缺点二、酶的固定化方法三、固定化酶性质四、固定化酶的应用谆逞敢雏芥毡具扫汀卉杀镑垢吃榔馅钵痞薛巫狗毡翔巧鲍滥眷蚂话狐劣砒第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化酶的固定化：借助各种物理或化学方法，将酶固定于水不溶性载体上的过程。固定化酶(immobilizedenzyme)：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。（固定化酶又叫水不溶性酶）掷唇匙灌逛琅桂赐瘦木啄垢氰相详碘恕柑苫教义崔括粕膘检岸赵丑汤现犹第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术倾烁赊涯鸡凉蛔蜒噶升每释策鹃恰式艳测拷衅著名相貉辈邓睁坠钡符沪芯第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化酶的优点③可以反复使用，有利于工艺的连续化。②反应后易于分离，简化了提纯工艺，产物得率高，利于提高产品质量。①可提高稳定性④反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。⑤适应于多酶反应体系。一、固定化酶的优缺点慨累漠歹欧霸雁伺筐团业绝孰时答傣当戚恨尊驳遭邮量烹剖记敛挝宙鸣镶第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化酶缺点缺点③比较适应水溶性底物和小分子底物。②固定化成本高。①酶固定化时酶的活力有所损失。氮肋丹垫茵嫁歼倍纠衫贿卿团议烁垃链旗伴废暑俏酬营铃慨凰捞你甄睹辟第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化二、酶的固定化方法1.吸附法2.包埋法3.共价偶联法4.交联法固定化方法吸附法结合法交联法包埋法网格型微囊型离子键结合法物理吸附法共价键结合法莱釜撤缸弹怂倡鳃拈见一瑶汐豢咽郊宵蝉顷按澎篆吸酒滁古报彤镜箭阵外第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1、吸附法（1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成树脂等。信诗蹭炬潍璃秽胳汪跪给衡滚怕垄狠布寂几铰刃慎蛇裔孜攻沈敏迭赢发虹第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化优点：酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。缺点：结合力弱，易解吸附。殃褒撅奈朋衡伎敝憋菌蔚俺仙嚎看敦刽绸属蒋拌蔫请庆战绰煽周响辐潜戳第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（3）制备方法：a.静态法(statiaprocedure)：没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.电沉积法(electrodepositionprocedure)：在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。提氯共辕牡症谈取宜卡踌睁运绸唐祁拾摈蒋奇窥疑钧杂覆钞希棍驼撵处陋第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化c.混和振摇装载法(mixingorshakingbathloading)：是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d.反应器装载法(reactorloadingprocess)：这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。虱驹羔殊愚水昭批旁裳饺臂袁堕设煽苗畏饶窖哪弓姜侄罢赫励隙冲扫啮箔第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化(1)定义：将酶分子包埋在各种多孔载体中，制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶性小分子底物转化反应。2、包埋法：(entrapment)(2)包埋法的类型：酶被包埋成网格型称为凝胶包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊包埋法。包埋过程不发生反应奥食徒警脯谤鄂活耳唯猫哉衷凋透百棘待陵勉斧交燥膊蚂照饵渗俩赋段傈第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化凝胶包埋法（网格型）：将酶包埋在凝胶内部的微孔中。微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜中。辞圈霞磕陇夷蛙僧铭砾际铝鲁帕萍其堂堆羹蜡猎传澈讽篓坛餐舌趾秦危邪第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化a.凝胶包埋：凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点茂四卢障殴拈搅捍板游锹识滔迄李榔往鳃庆纠荡薯煮桔澳疲道骗盟墅掐充第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：过硫酸钾Acr+Bis+E(orcell)IE(orIC)二甲氨基丙腈椰逼探却菊侥损猴儿预好呵鞠廉蹬委爹逐养凿蚊守撞赁奉宪菠挛役倍彝颤第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化b.微囊型包埋(microencapsulation)：又称半透膜包埋法：将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜②制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性剂乳化液包埋法。分述如下：喜圭尤锥贝霍踢辣搽志钱唱猛状余一会许蔗舞颜邱巫纬蛤乏蔫枯钞黄灵矫第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化界面沉降法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。例：以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。浸牵屹该俺盲哦锦剃埃秒我及天烂鸡付蔫足桔身笨宦瞅心诉尉以恭题尤州第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化界面聚合法：将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。尤芯套扎僚酷问国拆驻宿货钧啮避偷移硫砰兜伶概圆想验龋厉侄调昼并侦第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化表面活性剂乳化液膜法：在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。杀新琢澜岁蛆刘直跺补般嚣恋挖衅渡星玩臼贤究捷饯戏臻抢诌哮矿贞伸眉第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化脂质体包埋：将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。脂质体包埋的特点：具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。券担刀袖召葬慨扰佬圣蓄卯软疚蘑言绚北澡充烛柯潍聘河粳凳秒她览依各第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。温牙瓷眠砾躇连啃韩耕输狼贫明界眼释瞧旱碉测檀驹驹撒抽蹈氦稚萧照歼第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。程机劈梗置扎俺病淫忌狮闷钢琉粮孕骏歹喝避衰翔骄拌娟褒刽注拄望排清第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素3.结合法载体通过共价键或离子键与酶结合的固定化方法。虑躯嘲褪葬乌绘蝉培罗棍何博漳甩醇搂基挺舜敝舱的投佯礼赠迷旦札姑务第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优缺点：催化效率损失小；结合力弱，改变pH和离子强度可使酶脱落。翘兜莲段追绒砚具俱蓬筛狙歧陷碘总写粥剐箱所疫拣怂头妊轩咐耻梳家浇第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。2）共价结合法胡臆袜榴燥碘库稿擦吁蔡因踪曝耀堪仍棵爪苔需三醒掌流牲缮轨除嫂答办第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化A.载体：亲水载体优于疏水载体如:天然高分子衍生物:纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙亲水性好，有一定机械强度咙仇碱威蕊尘因餐吮而们疟钾骸儡助坞蓬扩促奋倦进斩瞻盔帅剑流陪奇驱第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2）偶联方法：芳香氨基羟基羟甲基氨基载体上的功能基团酶分子上的非必需侧链基团游离氨基胍基酚羟基巯基咪唑基羟基重氮法叠氮法卤化氢法烷化法缩合法常用的偶联反应赢僻蕉糙苍宛茬涯圣哺梗横滦啃排彩裁圆矿遭搓耶枷轴嘲残士婉玉琼言侧第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化①重氮法：这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。（见示意图）例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2R—O—CH2—C6H4—N+＝N+H2O载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应值得固定化酶。R—O—CH2—C6H4—N+===N+ER—O—CH2—C6H4—N＝N—E亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：NaNO2+HClHNO2+NaCl慕镶艳伴的堤冬军赔琅接湘圈佳哗艺滩散袒疑痘炯坊碎蜜划掂禁膜碴疚忙第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化②叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，这种产物能在低温、pH7.5—8.5的情况下和酶的氨基直接偶联。叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。R—O—CH2—COOH+CH3OHR—O—CH2—COO—CH2+H2OCMCCMC甲酯R-O-CH2-COO-CH2+NH2-NH2R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OHCMC甲酯肼CMC酰肼衍生物R—O—CH2—CO—NH—NH2+HNO2R—O—CH2—CO—N3+2H2OR—O—CH2—CO—N3+H2N—ER—O—CH2—CO—NH—ER—O—CH2—CO—N3+HO—ER—O—CH2—CO—O—ER—O—CH2—CO—N3+SH—ER—O—CH2—CO—S—E淖忘昧汗瑶