12基因工程的操作程序

复习回顾1、基因工程又称为？基因工程的原理是?2、基因工程中用到的工具中，“分子手术刀”是？来源是？其作用是？体现了酶的什么特性？作用部位是什么键？3、限制酶切割之后的结果是产生？从中轴线两侧切割得到的是什么末端？从中轴线处切开呢？4、获得目的基因需要切几个切口？产生几个黏性末端？切割质粒呢？5、“分子缝合针”是？根据什么分为两大类？哪两大类？这两类酶的区别是？6、DNA连接酶连接的是？DNA聚合酶连接的是？7、DNA连接酶作用于什么键？8、载体主要有哪几类？其中，最常用的是？它的本质是？9、载体必须具备的四个条件是？10、写出限制酶切割后的黏性末端。原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定问题1一：目的基因的获取如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。1.目的基因主要是指___________________编码蛋白质的基因目的基因指的是：也可以是具有调控作用的因子获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、人工合成目的基因反转录法化学合成法(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库1.基因文库概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）(一)从基因文库中获取目的基因3.基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库4.cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少部分基因全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以总结1、概念：PCR全称为________________，是一项在生物____复制_____________的核酸合成技术3、条件：2、原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制(二)利用PCR技术扩增目的基因模板（目的基因）原料(脱氧核苷酸)引物（一小段单链DNA）耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）温度控制4、操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。6、结果：5、扩增形式：指数形式（2n）在短时间内大量扩增目的基因7、过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物开始进行碱基互补配对，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示（三）人工合成目的基因反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。化学合成法DNA合成仪推测推测合成前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因问题43、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________获取目的基因的三种方法应用1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学合成法从基因文库获取的方法复习回顾1、基因工程的基本操作程序的四个步骤是？核心是？2、目的基因指的是什么基因？3、获取目的基因常用的三种方法是？其中人工合成法又包括哪两种?4、基因文库包括哪两类？5、PCR的原理是？PCR全称是？PCR扩增过程中的解旋方式是？PCR需要的条件有？6、基因表达载体的构建的目的是？7、一个基因表达载体的组成包括哪几部分？8、标记基因的作用是？9、启动子，终止子的位置，作用？起始密码子，终止密码子呢？二：基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录（与终止密码子区别）标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来3.基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口四个黏性末端DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端三、将目的基因导入受体细胞1转化概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2转化的实质：目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞一般是体细胞受精卵-------------4、目的基因导入受体细胞的方法1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞基因枪法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉（我国）（4）、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？全能性受限制（5）、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞（改变细胞壁的通透性）④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，目的基因-目的基因类型目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测问题4问题5——检查是否成功分子水平个体水平：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNA分子杂交、DNA探针分子杂交、DNA探针抗原-抗体杂交、抗体四、目的基因的检测与鉴定方法：接种实验转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段方法——DNA分子杂交技术变性变性知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养（4）除上述分子检测外，有时还需进行个体生物学水平的鉴定：如抗性特性——检查是否成功分子水平个体水平：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法、工具：方法、工具：方法、工具：DNA分子杂交、DNA探针分子杂交、DNA探针抗原-抗体杂交、抗体四、目的基因的检测与鉴定方法：接种实验归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：