九、染色体工程

第九章染色体工程23什么是染色体工程？染色体工程（chromosomeengineering）：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。4第一节人工诱导多倍体第二节雌、雄核发育第三节染色体显微操作技术第四节染色体转移技术第五节人工染色体5第一节人工诱导多倍体一．技术方法二．倍性鉴定方法三．优点与缺点6多倍体（polyploid）是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。在自然界中，多倍体现象在高等植物中相当多，而动物界却少得多。1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。7一、技术方法8多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出产生三倍体，或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、物理和化学的方法得到多倍体。91.生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poeciliaformosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。这种不同科、属、种之间的远源杂交，会导致第二极体不排出，而产生多倍体。10包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。⑴温度休克法：冷休克法（0～5℃）和热休克法（30℃）。定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法好，而温水性鱼类用冷休克效果较好。优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。2.物理学方法11⑵水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）抑制第二极体的放出或第一次卵裂来产生多倍体。优点：诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间短（3～5min），对受精卵损伤小、成活率高。缺点：需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。12有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。3.化学方法13二、倍性鉴定方法141.间接法：核体积测量、蛋白质电泳、系列化学分析、形态学检查等；2.直接法：染色体计数、DNA含量测定等。15核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。核体积测量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们采用，但缺乏准确性，亦测不出嵌合体，往往需要校正；生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。16染色体计数：是鉴定多倍性倍性的一种最为准确、直接方法，但缺点是费时；DNA含量测定：流式细胞仪。是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特殊的仪器设备。采用何种方法均有利有弊，进行鉴定主要依赖于所测样本的发育时期、实验要求和所具备的仪器设备条件。17三、优点与缺点18多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应用价值。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。种间杂种生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二倍体好。1.优点19准确的处理时间；诱导率、成活率及孵化率的提高；准确可靠的倍性鉴定方法的确定。2.缺点20第二节雌、雄核发育一．人工诱导雌核发育的方法二．雌核发育的鉴别三．雌核发育的意义四．人工诱导雄核发育21雌核发育（gynogenesis）是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。自然界中一些无脊椎动物和鱼类等存在。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。22凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。赫特威氏效应指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却只能起到激活卵球启动发育的作用。23一、人工诱导雌核发育的方法24物理方法：采用射线包括γ射线、X射线（效果较好）和紫外线（效果较差）等处理精子使精子的遗传物质失活。化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。显微手术法：采用显微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子遗传物质的失活25阻止第一次有丝分裂或第二极体的外排；利用温度、压力或化学方法，如冷休克、热休克、流体静水压、细胞松驰素B、聚乙二醇处理等。2.雌核染色体数目减少的阻止26首先将两个不同品系的近交系进行杂交。交配后，在精核与卵核尚未融合之前，从母鼠子宫内冲取受精卵，并用极细的吸管将精核去掉。在细胞松驰素B的处理下使雌核加倍，形成二倍体细胞。二倍体细胞在体外培养到囊胚期后，移植到养母的子宫内，使胚胎继续发育，直至出生。27二、雌核发育的鉴别28鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的指标为依据。也可以通过细胞学的研究，如若是雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂合雌性个体的子代应该都是纯合型；而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点与基因距离远离时，将明显增加杂合型子代的比例。29三、雌核发育的意义30为生产单性种群提供了可能。能迅速地产生同源型二倍体。提供某些致死突变种的生物品质。在农牧渔业生产中，可人工控制性别繁殖。广泛地用于进行基因-着丝点的定位研究。可利用产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因。31四、人工诱导雄核发育32雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用于冷冻基因库，保存种质资源，对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。33第三节染色体显微操作技术一．染色体分离二．染色体微切割341.原理：由于荧光染料Hoechst只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染料后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。一、染色体分离35①细胞分裂同步处理②染色体的荧光色素染色③染色体分离2.染色体分离的具体步骤36371.微细玻璃针切割法：采用特细的玻璃针（尖端直径约为0.17μm）在倒置显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。2.显微激光切割法：将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，利用激光共聚焦扫描显微系统，依靠高能量激光照射非选择细胞或染色体，使其受热蒸发，最后只留下目的染色体。二、染色体微切割38第四节染色体转移技术一．微细胞介导的基因转移法二．染色体介导转移法39将同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地传递下去。该技术称为染色体转移（或染色体转导）。微细胞介导的基因转移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色体介导的基因转移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）40一、微细胞介导的基因转移法微细胞（或微核体）：是指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。供体：微细胞优点：简化供体基因的表达、对受体细胞影响小、微核染色体稳定411.微细胞制备2.微细胞融合421.微细胞的制备用化学药剂和（如秋水仙素）阻断供体细胞的有丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期，从而在染色体周围逐渐形成核膜而成为众多的微核。然后在细胞松弛素B的作用下使微核逐渐突出细胞膜外。最后经过离心获得含有一个微核、四周有一薄层细胞质和质膜界限的微细胞。432.微细胞的融合制备的微细胞只能存活几个小时，但经融合可使其成为能够存活的整体细胞。常采用PEG作为细胞融合剂。最好选用带有营养缺陷标志的受体细胞。由于微细胞的染色体含有互补的原养型基因，微细胞与受体细胞形成的杂合细胞即可在特定的选择性培养基中生长而被筛选出来。44染色体介导转移法：是指分离得到相应的染色体后转入受体细胞的一种技术。基本步骤：⑴诱发细胞同步分裂；⑵阻断细胞分裂于中期；⑶破碎细胞；⑷离心收集中期染色体；⑸通过适当的分类转移到受体细胞中去。二、染色体介导转移法451.细胞同步化与染色体的分离2.染色体的转移3.受体细胞的分离与鉴定染色体介导转移的过程461.细胞同步化与染色体的分离用秋水仙素及合适的酶处理对数生长期的细胞离心收集中期相细胞沉淀洗涤数次在中性缓冲液中培育用注射针喷射细胞，使染色体释放离心收集染色体沉淀蔗糖梯度离心或用流式细胞测量仪分离单条染色体472.染色体的转移染色体可以通过细胞的吞噬作用而进入受体细胞。一般先采用磷酸钙和染色体一起沉淀，再用二甲基亚砜处理受体细胞，或采用卵磷脂与胆固醇制成的脂质体将染色体转入受体细胞。48分离：利用选择性培养基进行筛选鉴定：染色体组型分析同工酶分析其他方法3.导入基因的受体细胞的分离与鉴定49第五节人工染色体50染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN）和