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文章编号:1674-7054(2010)02-0000-00高蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选与鉴定陈圣丰1,林钦2,周永灿1,欧阳吉隆1,王世锋1,谢珍玉1(1.海南大学海洋学院,海南省热带水生生物技术重点实验室,海南海口570228;2.中国水产科学院南海水产研究所,广东广州510300;)摘要:从海南省文昌市、海口市的海水养殖池和天然海域中采集的海水与底泥样品中中分离和筛选出13株具有高蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌菌株,经菌落形态观察、标准生理生化分析和16SrDNA测序,确定所获得菌株均为野生型热带种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。关键词:地衣芽孢杆菌;高蛋白酶活性;热带种;筛选中图分类号:Q93-331文献标志码:A地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)能产生高效的胞外蛋白酶[1]、脂肪酶[2]和淀粉酶[3]等生物活性物质。近年来,地衣芽孢杆菌作为一种生态制剂广泛应用于水产养殖业中,它和其他种类的芽孢杆菌、光合细菌等有益微生物共同作用,可有效改善养殖水质,促进水产养殖生物的生长和发育[4,5]。地衣芽孢杆菌为多种污水和有机物无害化处理的常用菌种,也是重要的蛋白改性和助消化的有益微生物,受到国内学者的广泛关注。如杜珍辉等将地衣芽孢杆菌工业菌株应用于猪粪液的无害化处理[9];李红梅等研究了丹麦的地衣芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶对玉米蛋白改性的作用[10];刘波等人研究了美国的地衣芽孢杆菌菌株对鱼类消化功能的影响[11];谢航等人研究了从福建土壤中分离的地衣芽孢杆菌对养殖水体中残余饵料的降解特性[12]。但国内学者的研究均未涉及地衣芽孢杆菌的热带地理种群的应用研究。笔者采用脱脂牛奶平板法,从海南省文昌市、海口市的水产养殖池和天然海域中采集的海水与底泥样品中分离和筛选出具有高蛋白酶活性的菌株,并用表型鉴定和16SrDNA序列分析等方法对所分离的菌株进行鉴定,为热带海水养殖的水质净化提供高效的土著菌种参考菌株。1材料与方法1.1材料1.1.1样品用于分离筛选芽孢杆菌的样品为笔者于2008年12月和2009年5月从海南省文昌市、海口收稿日期:2010-04-08资助项目:农业科技成果转化项目(2009GB2E200302);科技人员服务企业项目(2009GJE20024);海南省重点科技项目(090501);农业部渔业生态环境重点开放实验室和广东省渔业生态环境重点实验室开放基金(2007-10).作者简介:陈圣丰(1983–),男,海南万宁人,海南大学海洋学院水产养殖专业2007级硕士研究生.通信作者:谢珍玉(1974–),男,江西吉安人,海南大学海洋学院博士、副教授.E-mail:xiezyscuta@163.com市的水产养殖池和天然海域中采集的海水和底泥样品。对照菌株为目前海南水产养殖中2种常见的有益微生物制剂所分离的菌株。1.1.2培养基芽孢杆菌选择性培养基配比:胰蛋白胨5g.L-1、酵母浸膏2.5g.L-1、葡萄糖1g.L-1、琼脂13g.L-1、NaCl70g.L-1、pH7.5。普通海水液体培养基配比:酵母浸膏1g.L-1、牛肉膏3g.L-1、蛋白胨5g.L-1、NaCl30g.L-1,pH7.5。普通海水固体培养基配比:在普通海水液体培养基基础上加入琼脂13g.L-1,pH7.5。1.1.3试剂固定液:ψ=10%的三氯乙酸。染色液:乙醇45mL、冰乙酸10mL、考马斯亮兰G-2500.25g、蒸馏水45mL。脱色液:乙醇50mL、冰乙酸75mL、蒸馏水875mL。1.2方法1.2.1菌种分离参考文献[6]方法制备芽孢杆菌选择性培养基。海水样品经摇匀后,取100μL均匀涂布于芽孢杆菌选择性培养基上,(50±1)℃培养24h,挑取表面粗糙、皱褶的乳白色单菌落为初筛的目标菌株。对底泥样品和市售的有益微生物制剂产品分别加适量灭菌海水充分均匀后进行分离,分离方法同上。1.2.2菌种保藏分别将初筛的326株目标单菌落接种于普通海水液体培养基,37℃培养24h,按1:1比例分别将菌液和ω=80%无菌甘油加入保种管,-80℃长期保存备用,每株4管。1.2.3高蛋白酶活性菌株的筛选目标菌株培养液的制备:用接种环挑取初筛的326株目标菌株,分别接种于普通海水液体培养基中,30℃180r·min-1振荡培养24h,6000r·min-1离心10min,收集上清液各10mL,并用0.20μm滤膜过滤除菌,获得目标菌株培养液,-20℃保存备用。脱脂奶平板法测定蛋白酶活:配制含ψ=5%无菌脱脂牛奶的灭菌海水琼脂平板,用直径4mm的打孔器在平板上均匀打孔,孔间距为25mm。在孔内加入20μL目标菌株培养液。以等量的10mg.L-1蛋白酶K和从市售有益微生物制剂产品中分离获得菌株的培养液为阳性对照,无菌海水为阴性对照。30℃下孵育24h,ψ=10%三氯乙酸固定2h,去除固定液后染色液染色,直至平板培养基充分着色,去除染色液后用脱色液充分脱色,使平板背景呈蓝色而水解圈为无色。用游标卡尺测量水解圈直径。每个样品设2个重复。继代培养:将经筛选的具有高蛋白酶活性(菌株培养液的水解圈较大)的菌株Pb-WC09005,在高温(50±1)℃,高盐NaCl70g.L-1的选择条件下进行20代继代培养,测定第20代菌株培养液的水解圈直径。每个样品设2个重复。1.2.4数据处理采用统计软件SPSS(StatisticalProgramforSocialSciences)的方差分析法对实验数据进行差异显著性分析。1.2.5高蛋白酶活性菌株的鉴定表型鉴定:以广东省微生物研究所生产的地衣芽孢杆菌ATCC11091和ATCC11946共2株标准菌株作对照,测定各分离的高蛋白酶活性菌株的形态与生理生化特征,按文献[7]进行鉴定,并参阅文献[8]确定属或种。16SrDNA序列测定:利用细菌16SrDNA通用引物Pf:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Pr:5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′(由上海生物工程公司合成)对高蛋白酶活性菌株进行PCR扩增,获得大小约为1500bp的片段。PCR反应体系为:ExTaqDNA聚合酶(5U.μL-1,含Mg2+)0.3μL,dNTP4μL,10×PCR缓冲液5μL,正向引物Pf(10μmol.L-1)5μL,反向引物Pr(10μmol.L-1)5μL,DNA模板2μL,加超纯水至总体积50μL。样品送至invitrogen广州分公司测序。将获得的序列提交到Genbank,利用在线软件Blastn2.0与该文库中的序列比对,同时采用DNAstar7.0软件与从GenBank中获得的同源性最高的25株细菌16SDNA序列进行多序列匹配排列,构建系统进化树。2结果2.1菌种分离从采集的样品中分离获得目标菌株326株,从2种市售有益微生物制剂产品中共分离获得目标菌株2株。2.2高蛋白酶活性菌株的筛选经蛋白酶活测定,确定高蛋白酶活性菌株共13株,各菌株的编号和来源以及其蛋白酶活性见表1,各菌株蛋白酶活性由高到低依次为:Pb-WC09005>Pb-WC09002>Pb-WC09009>Pb-WC09008>Pb-WC09006>Pb-WC090010>Pb-HK09001>Pb-SP09001>Pb-WC09003>Pb-WC09001>Pb-WC09004>Pb-HK09002。对各目标菌株蛋白酶活性差异显著性分析结果表明,除Pb-HK09002外,其它10株菌株均极显著高于10μg.mL-1的蛋白酶K的活性(P0.01);Pb-WC09002、Pb-WC09005、Pb-WC09009蛋白酶活性均极显著高于Pb-SP09001(P0.01);蛋白酶活性最高的Pb-WC09005菌株分离于海南文昌某对虾养殖池,其蛋白酶活性极显著高于从市售有益微生物制剂产品中分离的2株菌株(P0.01)。将蛋白酶活性最高的Pb-WC09005菌株传代20代后,第20代菌株的蛋白酶活性与第一代菌株相当,没有显著性差异(P0.05)。表113株高蛋白酶活性菌株的来源及其蛋白酶活性分析菌株编号来源水解圈直径(mm)Pb-WC09001文昌某对虾养殖池水体10.24±0.08ccPb-WC09002文昌某对虾养殖场排水口底泥12.32±0.03aa.ccPb-WC09003文昌某对虾养殖场周边海域水体10.30±0.21ccPb-WC09004文昌某对虾养殖池水体10.18±0.06ccPb-WC09005文昌某对虾养殖池水体14.16±0.04aa,bb,ccPb-WC09006文昌某对虾养殖池水体11.54±0.16ccPb-WC09008文昌某对虾养殖池水体11.64±0.14ccPb-WC09009文昌某对虾养殖池水体12.24±0.02aa.ccPb-WC09010文昌某对虾养殖池水体11.50±0.06ccPb-HK09001海口白沙门海域自然海水11.44±0.06ccPb-HK09002海口白沙门海域自然海水9.46±0.14Pb-SP09001某品牌超级底改(阳性对照)11.32±0.04Pb-SP09003某品牌产酶利生素粉剂(阳性对照)12.72±0.16蛋白酶K阳性对照9.12±0.02灭菌海水阴性对照0注:a.表示水解圈直径与Pb-SP09001存在显著差异(P0.05);aa.表示水解圈直径与Pb-SP09001存在极显著差异(P0.01);b.表示水解圈直径与Pb-SP09003存在显著差异(P0.05);bb.表示水解圈直径与Pb-SP09003存在极显著差异(P0.01);c.表示水解圈直径与10μg/ml蛋白酶K存在显著差异(P0.05);cc.表示水解圈直径与10μg/ml蛋白酶K存在极显著差异(P0.01)。2.3菌种鉴定2.3.1菌落特征和生理生化特征笔者所分离的13株目标菌株的菌落特征均为乳白色,扁平,表面粗糙、皱褶,边缘不整齐,培养24h的菌落直径为3~5mm。革兰氏染色结果表明,所有菌株均为革兰氏阳性。生理生化特征分析表明,除淀粉水解、明胶液化和对10%NaCl的耐受性3指标因菌株不同而存在一定差异外,其他检测指标均与地衣芽孢杆菌标准菌株一致(表2)。表213株高蛋白酶活性菌株的生理生化特征菌株编号淀粉水解明胶液化硝酸盐还原柠檬酸盐葡萄糖果糖甘露醇D-核糖对NaCl的耐受性3%6%7%10%Pb-SP09001+-+-++--++++Pb-SP09003--+-++--++++Pb-WC09001+-+-++--++++Pb-WC09002--+-++--++++Pb-WC09003--+-++--++++Pb-WC09004-++-++--++++Pb-WC09005--+-++--++++Pb-WC09006--+-++--++++Pb-WC09008--+-++--++++Pb-WC09009--+-++--++++Pb-WC090010--+-++--++++Pb-HK09001-++-++--+++-Pb-HK09002+-+-++--++++ATCC11946+-+-++--++++ATCC11091+++-++--++++注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。ATCC11091和ATCC11946为地衣芽孢杆菌标准菌株。2.3.2菌株16SrDNA序列的系统进化分析分别以各目标菌株的基因组总DNA为模板,经标准PCR扩增,除Pb-HK09001、Pb-WC09008和Pb-WC09009分别产生1510,1512,1512bp的扩增片段外,其余10株目标菌株都产生了1511bp的16SrDNA产物。测序后,将所得序列提交至Genbank中,登录号分别为HM006899、HM006900、HM006901、HM006902、HM006903、HM006904、HM006905、HM006906、HM006907、HM006908、HM006909、HM006897、HM006898。将获得的16SrDN
本文标题:高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选与鉴定
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