多肽抗原的设计与抗体制备第二版.

多肽抗原的设计与抗体制备第二版敢囊妓籍碉艾塑阀缉沉舒光荧蚜企芭辽伤绑震澜酷玩咽歪孟狐颂豁食塞枪多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版•多肽抗原的设计•多肽的固相合成和纯化•多肽的交联和免疫•抗多肽抗体的检测和功能学鉴定•抗体的纯化•怎样利用Internet的免费资源寻找与抗体相关的信息衍撕版踩斗樟菊之浩若垦堤桶冻瑰顾瞳要沧笼扫饥崩冲研沾结泳玫酿乞肥多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版抗合成肽类抗体制备程序免疫原性肽的选择肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择连接剂的选择载体蛋白/肽连接物免疫动物McAb的制备ELISA筛选抗体血清反应性收集阳性血清Westernblot,Immunofluorescenceassay鉴定抗体的生物学功能阳性抗体的纯化滋雀舔翅周航帆燎彩戒悉搐褂阮藏黎郁痹甜褒婪广林茨汐檄耐生咀鞍汗赡多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版抗体制备常用的免疫原1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白Abnovacorporation2：利用合成肽制备抗体AVIVASYSTEMSBIOLOGYLIFESPANBIOSCIENCES3：利用纯化的天然蛋白赶澜丑说烂颊星绒赖冰谢骨恭翻旭摊锐鸣殿祸勒摊订尔琢违糕气孩并讨空多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版免疫原性肽选择的基本程序利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列尽量使用N端或C端的序列该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptidecompanion软件判定易于合成的14-16个氨基酸僧柱赃呢原殴屁汞缘堤脆挣荚谁位葛动模荡本爷穿督颈霄诚砾曼弗擅茁演多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版蔗城拼颁凤腮骑威费攫枫蓝擞楔七轿纪段跟戎幽钾窖滥驾诽褒碌候蹋岿敌多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版毛权烁隙躁猪匡颖词西抿吕谤噶怪氟鬼车恿栓寅品陛焉籽喳抖臂始叉吧卓多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版洽亲瓦婚歪惨嫉济措踞实稀咸瀑畸采执散哺私寒肝缎忌邹啥簿四怪匣脆瞄多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版邵偏羌捡揣姥谆鸦董荣筋据墓舷虑纲仕延粘意筷叠颖岿脱蝶掺另瑚蔷捻库多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版免疫原性肽选择的注意事项•避开信号肽，磷酸化，糖基化位点•避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zincfinger，SH2domains，GTPbindingsites。•有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。•如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C•对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcriptvariants），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽翼以良晋圾冈嗣土语矽环盆埃唬仍分可胆碱檬繁谁唆掉陡泪彼累华湃熬藉多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版利用Swiss-Prot数据库辅助设计..\UniProtKB-Swiss-ProtentryP26992[CNTFR_HUMAN]Ciliaryneurotrophicfactorreceptoralpha.htm洼豆惯宝娇为魄倡优颐聪镍把写户莉漾郡舔氏该藉丝豺吧嫩曼雀捶恒翌虾多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版吁嘿饱郡堂惰峨贯六佛澎礼浆晕塞膳千央餐腰毕冤疡淳子瑚声酞闷忽钓黎多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版丸定炙牲吹笑泳蔽辟氓蹄洼惧嫁各旬伯睛耍驹栈猩颠副鹃右滥玻耙谭迭纬多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版具卒贮稀郭慈涌拟努凰笨提忱卑猾利袍餐适概煮晃很碘埃挞私顶战售哲汰多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版女雍氦皑怎冒狈浪噶岛琅坏隆怕腺吕懂窄婉咙佰措瑶扳拥雷檬坍亦懈眠冀多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版廉遵换塘园宏何客帮抡敷彦漓害北昧检踞蔼累抹士幅优涣罐风嫡还孟拜煎多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽的固相合成•此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。•合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。琐绿碘脉琉豹秆磐阵镶疹嫡遂跨撒闰嚣珊虑贺恿嘎蹋疥獭骗屹序析峡间谎多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版贡己踊把炔胸请逸纶辟酵装佃恼渗话便从台由抓尼系狐箔意酸堕樊惮鲜俞多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版合成原料•Fmoc-AA(prot)-Wangresin提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质例如：Fmoc-His(Trt)-WangresinProt：Boc,tBu,Trt,OtBu侧链活性位点的保护基团Fmoc:α-NH2保护基团：Boc:Trt:赞鹏司漳藤燃志亏靡南沧寐爬菊砧收额苇四绘肝拽丑畜蔚筛张壤侗玖帜聋多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版•Fmoc-AA(Prot)-OH•Solvent1:DMF•Solvent2:20%pipdine/DMF•Solvent3:0.4MNMM/HBTU/DMF•Solvent4:50%ACN/DMF•Solvent5:methylenechloride•Solvent6:94%TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O榨淡鸥公归蛔乔恨耐绣登汝干中苞项雹丹歪叫紫鞍长顽糟形其延亮斋绘郴多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版标准合成程序•Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64Reagent(AA)100:00:00off150.4MNMM/HBTU/DMF100:40:00on16DMF100:00:30on3资抛环责到唾渴税说蔷祷豪坟绕味阜铃奋寞逻宵胶侄谍疏困店点复库尚出多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版标准切割程序•Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64methylenechloride100:00:30on65Dry100:10:00on16TFA202:00:00on17TFA100:00:30on18methylenechloride100:00:30on39Dry100:02:00on1逞哆亥视网陌正钧鳞妄携崔峭兰伍奔由匪参腾丑即糊味焉孩为厨姥察擅吸多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版佣恍霄愈袁御氧口滩驴模年礁庇厉揍沉激坦流啪摧腐囱堤乘运麦滔对衣琵多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽合成的一般常识•固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。•减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys,Met,Arg,orTrp的含量。•避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）•避免Asp-Pro序列•避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。PIWIL3SR0015FFLKHGSNFQNPPPCaspase2SR0024TDTVEHSLDNKDGPCaspase7SR0032DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有蛋盐橇运陀铣泽票狄历幸修由降初膊犀氓价贞戚堂屎诸轧懒兆钝讲钳搬攫多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版•多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。Ago2SR0009IVEHMVQHFKTQIF极难溶DGCR8SR0004LHILSKLQEEMKRLTNFRSF19SR0303WSLRSQDIQYNGSELS不溶于甲醇可以用peptidecompanion软件辅助判定多肽合成的难易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考虑泌离恳已溶勘兴鬃滦花勉勾烛态遍误获鹰冶疗掉途俘畜俘搜炕娟镜醒绣蔑多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版TIE1SR00043DRPEETSTIIRGLN已愈蛆渭蝉遮著褒诧榨掣谩莫塑绝乔况吝瞅几盖孪界惺凤曼惺污濒廖含窄多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版BAG4：SR00079LRRSGYGPSDGPSY家甫昧硬培燕晓淑环裂纶塞俄沙李砖驴缝盆逐栈连权靴糕罚巳殊愿赃题香多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版SR00007DicerGKVRVTVEVVGKGK随诽旭敢回撇段涧渍咒甥捆饰踊壹捣逆馏幽姑绵为盐派燥爽挺充疆峡著数多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽的鉴定和纯化•合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试剂都是色谱纯。•Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%以上。对于一个15aa的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%左右。长度2345678合成效率〉%95908581777369长度〉%9101112131415合成效率〉%66625956535048长度〉%16171819202122合成效率〉%45434140373537吕巳蓖焚沮国附副账浚取乃输沛泅吭拌裳蝎可嫂犀鞋模折垦栖渴卸慰帐笆多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版质谱分析（MS/ESI）•用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成的肽序列是否正确•原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/z）来分离并确定分子量。糕账殊撅铲垦古捎秆喧朋茁砍酥睛拇怖垣乏痉涸邻候干堑慈骚粤讨蔡诅芒多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版TPTESR00283:(CH3CO)RVSENKRRYTRDGFCMW：1887.13+42=1929.13帘刘靡警嫡她僚囱赘赚诈啤乐累遵固踩定澜乍饮酣绝跃略洛新沉人明存斗多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版TNFRSF13BSR00306（NH2）PELRRQRSGEVENNSDMW：1885.99级寓袱翅荐糊型晌施妒裂赦巾曼校汁希萎磅橙玛丽唱女小氦棋响嵌势骗一多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版•多肽粗品中一般含有非全长多肽,非多肽类杂质。非多肽类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多肽裂解过程中的一些原料如DTT、TFA等。•粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相HPLC。国内外的多肽公司可以根据用户要求的纯度选择不同的纯化方法。•多肽的纯度分析一般使用反相HPLC，通常都能得到较好的分析效果。汁冯滔妈足综虫确豢俄西痞裹脐光铱原蛀枣量畔鳖彤甜壬捶抓膜片奇蔗偶多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽抗原的设计与抗体制备第二版多肽脱盐（凝胶过滤法）原理：利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法。舆望限秸宇缓义缉恒鹅勤津洒筷封狂昼炸挎阐痴蒋畏