蛋白浓度测定

蛋白浓度测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋白质含量方法的比较方法测定范围（μg/ml）不同种类蛋白的差异最大吸收波长(nm)特点凯氏定氮法小标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法100—1000大280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000小540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法20—500大750灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝G-25050—500大595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCA50—500大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。试验一：BCA法BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。主要特点1.准确灵敏,线性范围广：BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。试剂要求BCA试剂A,B液室温保存，蛋白标准(5mg/ml)-20℃保存仪器准备96孔板，酶标仪，37℃恒温箱使用说明1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按体积比A：B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2.稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100ul（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20ul。或者依照下面的表格中设置的浓度做标准曲线。3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20ul。一般蛋白样品可以几个不同的稀释比例检测，常用的是每孔中加入1ul，2ul，4ul样品，补加PBS到20ul。4.各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30分钟。5.冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。20ul体系蛋白浓度mg/ml加入C液量ul补足PBS量ul00200.050.219.80.10.419.60.20.819.20.31.218.80.41.618.40.52180.62.417.60.72.817.20.83.216.80.93.616.414161.561428122.5101031283.514641645200注意事项1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解,如发现细菌污染则应丢弃。2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。3．要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔,每次均应做标准曲线。4．当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。5．需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。二、考马氏亮蓝G－250染色法（Bradford法）此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。【原理】考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。【操作步骤】1、标准曲线的制备：按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。编号123456蛋白标准(ml)00.020.040.060.080.10蒸馏水(ml)0.100.080.060.040.020染色液(ml)333333在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清蛋白质测定稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。试剂(毫升)1(空白管)2(标准管)3(样品管)蒸馏水0.1——蛋白质标准—0.1—稀释血清——0.1染色液333【计算】每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）＝【试剂】1、考马氏亮蓝G－250染色液：称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。2、蛋白标准（0.1mg/ml）准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。【注意事项】1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1％SDS、1％TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/LHCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。三、紫外分光光度法紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。【原理】蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。【操作】将待测蛋白质溶液适当稀释K倍，在紫外分光度计中分别测定样品在10mm光径石英比色皿中，分别在280nm及260nm两种波长下的吸光度值A280和A260。【计算】1、当蛋白样品的吸光收比值A280／A260约为1.8，可用下面的公试进行计算：蛋白质浓度（mg/ml）＝（1.45A280－0.74A260）×K（稀释倍数）2、也可以先计算出A280／A260的比值后从下表中查出校正因子“F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：蛋白质浓度（mg/ml）＝F×A280×KA280/A260核酸(%)FA280/A260核酸(%)F1.750.001.1160.8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.6321.520.501.0540.8046.500.6071.400.751.0230.7847.000.5851.361.000.9940.7677.500.5651.301.250.9750.7538.000.5451.251.500.9440.7309.000.5081.162.000.8990.70510.000.4781.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.3220.9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682注：一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为1.8，而核酸A280/A260的比值约为0.5。【方法评价】操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。四、双缩脲法【原理】利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。【操作】1、取中试管4支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8％硫酸钠—亚硫酸钠1ml，置“1”管中备用。2、吸取血清0.2ml于另一试管中，加27.8％硫酸钠一亚硫酸钠4.8ml，用拇指压住管口倒转混合5～6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管“4”中（总蛋白测定管）。3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管“3”（白蛋白测定管）。4、另用一支1ml刻度吸管吸取标准血清1ml，置管“2”中（标准管）。5、于上述4支试管中分别加入双缩脲试剂4ml，混匀。6、在室温下放置10分钟后，以管“1”（空白管）调零，在540nm的波长下进行比色