超氧化物歧化酶

1/6超氧化物歧化酶(SOD)简述YB2012级生物技术摘要：超氧化物歧化酶首先由Mann和Keilin从牛红细胞中分离提取出,是生物体内一种重要的抗氧化酶,由于其具有清除生物体内超氧阴离子自由基的作用,而引起广大学者的关注。本文概述了SOD的分类、结构、理化性质及研究进展,并对其应用前景进行了展望。关键词：超氧化物歧化酶;SOD;理化性质生物体内低浓度超氧阴离子自由基(O-2)是维持生命活动所必需的,其浓度过高时,可引起机体组织细胞氧化损伤,导致机体发生疾病,甚至死亡。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,简称SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶,具有抗衰老、抗癌、防白内障等作用[1],因而受到全世界学术界广泛关注,使之成为涉及分子生物学、微生物学、医学等学科领域及医药、化工、食品等生产行业的一个热门研究课题[2]。1.SOD的分类SOD广泛存在于动、植物及微生物中[1]。根据其结合金属种类不同,可分为三类:第一类为Cu·Zn-SOD,呈蓝绿色,相对分子量约为32kDa,主要存在于真核细胞细胞浆、叶绿体和过氧化物酶体内;第二类为Mn-SOD,呈紫红色,相对分子量约为40kDa,主要存在于真核细胞线粒体和原核细胞中;第三类为Fe-SOD,呈黄褐色,相对分子量约为38.7kDa,主要存在于原核细胞及一些植物中[2]。2.SOD的结构1975年Richardson得到了Cu•Zn-SOD的三维结构[5],发现它是由2个基本相似的亚基组成的二聚体,且每个亚基含有1个铜原子和1个锌原子。2个相同亚基之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合,类似于圆筒的端面。Cu•Zn-SOD的单个亚基活性中心结构见图1。从图中可知Cu与4个来自组氨酸残基(His44,46,61,118)的咪唑氮配位呈现1个三角双锥畸变的四方锥构型,Zn则与3个来自组氨酸残基(His61,69,78)的咪唑2/6氮和1个天门冬氨酸残基(Asp81)的羧基氧配位,呈畸变的四面体构型。Mn-SOD和Fe-SOD的结构则比较简单,且二者相似,每个亚基的活性中心金属离子,都是与1个水分子和3个组氨酸(His)残基及1个天门冬氨酸(Asp)残基的羧基氧配位,呈畸变四方锥构型[6]。Mn-SOD和Fe-SOD一般为二聚体或四聚体,每个亚基含0.5一1.0个Mn和Fe原子。它们在空间结构上与Cu·Zn-SOD不同,含有较高程度的。一螺旋,而件折登较少。现已有多种生物中的SOD的三维结构登录到GenBank中,并且对其内部结构特征进行了分析。3.SOD的理化性质3.1SOD的主要物化特性近年来很多专家对SOD的物化特性进行了系统研究,研究结果表明:SOD属酸性蛋白酶,对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定[7]。将三类SOD的主要物化特性列于表1。Joan等人指出不同来源的Cu·Zn-SOD具有较高的同源性,它们的物化特性也很相似,据推测它们可能由同一原始酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性,它们可能由另一原始酶进化而成。3.2SOD的活性中心和催化机理三类SOD的活性中心都含有金属离子。如采用物理或化学方法除去金属离子，则酶活丧失;如重新加上金属离子，则酶活又恢复。Cu·Zn-SOD的活性中心形态像个椭圆形口袋，口袋底部的Cu2+与4个His和1个H2O配位，E2+与3个His和1个Asp配位。Cu和Zn离子之间通过共同连接1个His而构成咪唑桥结构[8]。口袋长15A°、宽9A°、深6A°，口袋底部是Cu2+和Zn2+存在的部位，底物就结合于口袋之中。活性中心的His对酶活性至关重要，该残基受损，酶活性丧失，位于活性中心附近且与Cu2+相距6A°的精氨酸143，因具有正电荷，是进人活性中心的诱导者，并提供H+以加快歧化速度。如果该酶残基被修饰，大部分正电荷消失，不利的进人，酶3/6活性降低99%。Cu2+和Zn2+对活性中心的作用亦不同，Cu2+是必需的，任何金属取代Cu2+都可使酶失活，而Zn2+被Co2+,Hg2+、Cd2+取代而不影响活性[7]。Mn-SOD和Fe-SOD的活性中心的金属离子与3个His,1个Asp和1个H2O配位。三类SOD的活性中心均含有金属离子,His、Asp和H2O[8]。氧化物可以与Cu2+和Zn2+配位而使酶失活,但不受乙醇、氯仿影响;金属的鳌合剂如EDTA可除去Cu2+、Zn2+,导致酸失活;H2O2能与Cu2+反应,使Cu2+变成Cu+,导致酶失活;添加·OH清除剂可保护酶的天然结构。Mn-SOD具有抗CN-能力,但可被乙醇、氯仿破坏,Mn-SOD可由氧诱导产生,其增加是和高压氧的量有关,故认为Mn-SOD是内源性0夏的“清道夫”。Fe-SOD能抗CN-,但氧不能诱导Fe-SOD的产生,Fe-SOD是外源性的清除剂。SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶,它的作用底物是超氧阴离子,它催化超氧阴离子发生歧化反应,从而清除q。其催化机理是:SOD(氧化型)+→SOD-（还原型）+，SOD-（还原型）+→SOD(氧化型)+H2O2，总反应式：3.3SOD的化学修饰SOD作为药用酶用于临床受以下因素的影响:①半衰期短,通常只有6~10min;②分子量大,不易透过细胞膜;③抗原性;④如用于口服,易被蛋白水解酶水解。鉴于上述不利因素,对SOD分子进行改造就显得十分重要,近年很多专家对SOD分子的修饰进行了研究[9~11],目的是为了提高SOD的稳定性。实验表明:修饰酶不仅完全保留了天然酶的活性,而且在耐热、耐酸、耐碱和抗胃蛋白酶水解能力等方面都明显地优于天然酶,修饰酶较天然酶稳定(表2,图2),特别是酶经修饰后大大延长了在体内停留时间[12]。目前对SOD进行分子修饰改造的途径有:①对SOD氨基酸残基进行化学修饰;②用水溶性大分子对SOD进行共价修饰;③对SOD进行酶切修饰[7]。近年来用水溶性大分子对SOD修饰研究和应用较多,原因有3个方面:①反应条件温和,且酶活保持较好;②形成共价蛋白加合物水溶性好;③具有较好的生物相容性[10]。天然牛血SOD的t1/2的6min,而右旋糖酐SOD、低分子聚蔗糖SOD、高分子聚蔗糖SOD、聚乙二醇SOD的t1/2;分别为7,14,24,35h[12]。并且聚4/6乙二醇与SOD共价修饰后,除可使半衰期延长外,还可粘附于血管内皮细胞表面,增加了其抗自由基作用[13]。另据Michelson等人报道,SOD被脂质体包裹可明显延长半衰期。将SOD包人脂质质体后不但可提高SOD进人细胞的量,还可以选择性地将SOD导人到一定的器官中[14]。4.SOD的研究进展超氧化物歧化酶是生物体防御氧化损伤重要的生物酶。近些年,国内外学者除对动物SOD进行研究外,还对植物SOD和微生物SOD进行了研究。4.1微生物SOD的研究进展近几十年,SOD一直是国内外学者研究的热点。但他们的研究大多集中于从动物血液或脏器中提取SOD,易受原料来源、产品得率、稳定性及安全性等方面的限制。微生物具有原料便宜易得,可大规模生产的优势,因而,近些年很多学者都致力于用微生物发酵生产SOD的研究。上世纪80年代后,美国和日本已先后开发了用发酵法生产SOD,大大降低了生产成本。目前,国内外在微生物SOD的菌种选育、发酵工艺、分离提纯、生理学研究、基因克隆表达及SOD应用方面都取得一定的研究进展[15,16]。4.2植物SOD的研究进展植物细胞在正常代谢活动和逆境条件下均能产生活性氧。近年来,国内外的专家学者主要研究了SOD与植物抗逆性的关系。研究表明,在逆境条件下,植物的抗性与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。环境胁迫能诱导植物SOD基因的表达。当前,不同类型的SOD基因已被转化到多种植物中,有实验结果表明,SOD在转基因植物中的过量表达可以不同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力[17,18]。因此,可利用基因工程方法来获得抗逆植株。4.3动物SOD的研究进展目前,SOD作为O2-特异清除剂,已被广泛应用于医药、食品及化妆品行业当中。4.3.1SOD在医药行业中的应用SOD由于半衰期短、分子量大、易失活等缺点,不利于临床使用,而基因工程手段对SOD分子进行化学修饰则成为近些年的研究热点。实验表明,修饰酶不仅完全保留了天然酶的活5/6性,在耐热、耐酸碱度、抵抗蛋白酶水解以及稳定性方面也明显优于天然酶,大大延长了它在体内停留的时间[4]。当前已有多种药用SOD应用于临床中,主要集中于抗炎症、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤和自身免疫系统疾病等与活性氧损伤有密切关系的病症中。4.3.2SOD在食品工业中的应用SOD应用于食品工业中,主要是作为食品添加剂和重要的功能性基料。目前,已开发的产品有以大蒜为原料生产的大蒜粉、大蒜油,以猕猴桃为原料生产的猕猴桃汁以及添加SOD的牛奶、咖啡、酸奶、啤酒等保健食品。4.3.3SOD在化妆品行业中的应用由于SOD具有抗衰老作用,它已被广泛应用于化妆品中,对于治疗皱纹、雀斑、粉刺、色素沉着等具有明显作用。因此,含有SOD的化妆品倍受女性青睐。5.展望目前,SOD作为药用酶用于临床已有深入研究,但由于其制备纯化工艺复杂,生产成本高,因而在食品中应用不是很广泛,鉴于从微生物中提取SOD存在诸多优点,因此用微生物发酵生产SOD有可能不经过提纯直接用于食品、化妆品及食品添加剂中。随着研究进一步加深,利用微生物生产SOD进入产业化阶段,相信其在医药、食品、化妆品等方面应用更加广泛。参考文献[1]丁书茂,杨旭.超氧化物歧化酶及其模拟化合物研究进展[J].高等函授学报(自然科学版),2004,17(1):1-5.[2]张晓燕.超氧化物歧化酶的研究现状及在食品中的应用综述[J].扬州职业大学学报,2002,6(1):34-37.[3]蔡敬杰,樊志.超氧化物歧化酶的研究进展[J].天津化工,1997,2:2-4.[4]王震宙,陈红兰.SOD的应用研究进展[J].食品科技:29-30.[5]陈忠宁.毛宗万,唐雯霞.铜锌超氧化物歧化酶的结构机理及其模拟研究进展[J].化学通报.1993,(6)：1-7.[6]沈良.郭洪.超氧化物歧化醉及其摸拟研究[J].杭州师范学院学报.2002，1(3):54-70.[7]张博润等.SOD的研究进展和应用前景[J].微生物学通报.1992,19(6):352-357.[8]顾永清.SOD及其在生物学中的应用[J].生物学通报,1993,28(7):8-11.[9]吴云等·右旋糖酐对超氧化物歧化酶的化学修饰及其某些性质的研究[J].生物化学与生6/6物物理学报,1986,18(3):308-310.[10]区耀华等.超氧化物歧化酶化学修饰的初步研究[J].生物化学与生物物理进展,1989,16(3):203-205.[11]白如琴等.天然与修饰超氧化物歧化酶某些物理性质比较[J].山西大学学报(自然版),1994,17(2):196-199.[12]袁勤生等.超氧化物歧化酶研究进展[J]·中国药学杂志,1989,24(7):387-391.[13]罗晓波.自由基和抗自由基药物在心肌缺血灌注损伤中的研究进展[J].中国药学通报,1992,8(4):l74-177.[14]陈雨亭等.SOD脂质体及临床应用[J].生物化学与生物物理进展,1989,16(l):23-26.[15]王素芳,蒋琳兰,赵树进.微生物超氧化物歧化酶的研究进展[J].药物生物技术,2002,9(6):378-380.[16]杨明琰,张晓琦等.微生物产超氧化物歧化酶的研究进展[J].微生物学杂志,2004,24(1):49-51.[17]马旭俊,朱大海.植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究进展[J].遗传,2003,25(2):225-231.[18]覃鹏,刘飞虎,梁雪妮.超氧化物歧化酶与植物抗逆性[J].黑龙江农业科学,2002,(1):31-34.