肿瘤免疫治疗的新方法CAR-T细胞治疗

肿瘤免疫治疗的新方法CAR-T细胞治疗秦皇岛市第四医院病理科康文喜康瑶满迪随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，肿瘤免疫治疗近年来取得了长足的进步。以嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)修饰T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗的成就受到世界瞩目，在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，给人类抗击肿瘤带来了新的曙光。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)在体外进行基因重组,生成重组质粒,再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞胞膜上,使患者T细胞表达肿瘤抗原受体,转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞,称之为嵌合抗原受体T细胞（ChimericAntigenReceptorT-Cell，CAR-T）。1989年Grooss等首次提出ＣＡＲ-Ｔ细胞这一概念，多年来科学家经过不断的深入研究，ＣＡＲ-Ｔ细胞技术已经研制出三代。第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体和免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）组成。然而，ITAM发出的激活信号只能引起T细胞短暂的分裂和较低水平的细胞因子分泌，不能提供长时间的多克隆扩增和持续的体内抗肿瘤效应。给患者输注第一代CAR-T细胞2天后,CAR-T细胞在体内可大量繁殖,但1个月后迅速下降至难以检测的水平,也没有观察到对肿瘤的免疫应答反应。虽然对第一代CAR-T细胞的研究较多,但是大多数试验在细胞扩增、体内存活时间、细胞因子分泌等方面还存在很多问题,没有达到预期的临床效果。研究表明,T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号,由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号,通过CD28/B7等重要的共刺激分子,促进IL-2合成,并使T细胞充分活化及免于凋亡。对于初始型T细胞(未与抗原接触的T细胞),如果只有信号1而没有信号2，T细胞就不能发挥正常作用；即使T细胞与抗原接触,若没有协同刺激信号,细胞也不能发挥正常功能。一种仅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受体,如果没有协同刺激信号2,也是无法激活CAR-T细胞。因此，依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号，因此第二代和第三代CAR引入了共刺激分子信号，提高了T细胞的细胞毒性、增殖活性、存活时间、细胞因子释放等功能。科学家们用电穿孔、转座子系统、逆转录病毒、慢病毒等基因转导方法修饰T细胞，使T细胞的抗肿瘤作用现出了令人满意的效果。Porter等和Kalos等研究用第二代CAR-T细胞靶向治疗3例慢性淋巴细胞白血病,接受治疗的3例患者回输CAR-T细胞总数为1.4×107~1.1×109,CAR-T细胞不仅在体内扩增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的时间也超过6个月,分泌的细胞因子如干扰素-γ、CXCL9等较治疗前显著增高。接受治疗的3例患者中,2例达到完全缓解,1例部分缓解,疗效得到肯定。2013年,Brentjens等用CD19-CAR-T细胞治疗5例急性B细胞性白血病患者，通过治疗,5例肿瘤迅速减小,其中1例患者治疗8天之后就很快得到完全缓解,3例患者缓解期长达5-24个月。该临床试验结果表明，CAR-T细胞治疗成人急性B细胞性白血病是有效的。虽然患者对该疗法能够耐受,但是也出现了细胞因子相关的毒性反应,并且与肿瘤负荷成正相关。Morgan等对一例结肠癌合并肝和肺转移的患者给予第三代CAR-T细胞治疗。患者输入CAR-T细胞4小时后，血液就检测出高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等细胞因子。但患者发生“细胞因子风暴”,于5后天死亡。这也是迄今为止公布的最为严重的1例CAR-T细胞相关的不良反应。由于目前第三代CAR-T细胞临床应用还比较少,故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T细胞,以及选择怎样的共刺激分子组合,还需进一步观察。随着细胞免疫治疗肿瘤的进展,嵌合抗原受体修饰的T细胞在临床应用中的作用越来越受到人们的重视。通过探索完美的CAR信号组合,调节适宜的CAR亲和性,增加人工基因调控开关,产生合理的细胞因子分泌,诱导T细胞特异性归巢等,相信第四代甚至第五代CAR-T细胞也将很快应用于临床。除此之外,嵌合抗原受体也不仅仅只是修饰T细胞,它还可以修饰CIK细胞、NK细胞以及γδT细胞等。例如,德国波恩大学的研究人员从结直肠癌患者外周血中采集和培养CIK细胞,并利用CEA+抗体特异性的CAR对CIK细胞进行改造,使CIK细胞获得CAR的特性。将CAR-CIK细胞与CEA+肿瘤细胞共培养后,发现其分泌的IFN-γ,要高于与CEA-肿瘤细胞共培养情况;而用未改造的CIK细胞与CEA+/CEA–分别共培养,却未观察到IFN-γ分泌增加,且CAR-CIK细胞的细胞毒效应也比未改造的CIK细胞要高。当前构建的嵌合抗原受体存在固定的抗原特异性,这意味着它们每次只能靶向一种类型的肿瘤抗原。将来可以设计构建一种更加通用性的嵌合抗原受体框,最终可用于同时或依次靶向多种肿瘤抗原,这样将更大程度解决肿瘤免疫逃逸引起的复发和转移等问题,成为疗效更确切的过继性免疫细胞治疗方法,给肿瘤治疗带来新的希望。CA-T细胞治疗的副作用：1、CAR修饰T细胞的脱靶效应：CAR修饰T细胞临床应用的一个重要问题是脱靶效应。作为分子靶点的肿瘤抗原中，真正的肿瘤特异性抗原很少，大多数为肿瘤相关抗原。如果这些抗原在重要脏器上也有表达，势必造成免疫损伤。当然一些组织可能通过天然的屏障免于受到CAR修饰T细胞的攻击，如睾丸，但是体内大多数组织不具备这些屏障。例如，用特异性识别碳酸酐酶-IX(CA-IX)CAR修饰T细胞治疗转移性肾细胞癌可能会造成肝细胞毒性，因为正常肝脏细胞上低水平表达CA-IX。Rosenberg等报道1例接受CD19-CAR修饰T细胞治疗淋巴瘤患者，外周血CD19+淋巴瘤细胞消除的同时，其B细胞也消失长达39周，表明脱靶效应对健康成熟B细胞存在潜在威胁。2、细胞因子风暴：CAR-T细胞与肿瘤抗原结合会导致T细胞活化，这一结果可能导致大量的炎症细胞因子释放到循环中，如IFN-γ和TNF-α等，即所谓“细胞因子风暴”，大量的炎症细胞因子会引起急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭，有时甚至危及患者生命，因此密切监测重要器官的功能是必需的。3、CAR-T细胞引起的移植物抗宿主病(GVHD)样损伤：CAR-T细胞应用的另一个问题是发生类似于异基因造血干细胞移植中出现的GVHD。移植物抗肿瘤作用常常伴随着免疫效应细胞对正常组织的攻击，尤其是当肿瘤相关抗原在健康组织也有表达的时候，其抗癌效能与其毒性程度相关联。例如靶向MART-1的CAR+T细胞治疗黑素瘤的临床试验中，一些患者出现了皮疹、葡萄膜炎或听力减退，严重者出现多器官功能衰竭而死亡。如何保证发挥CAR-T细胞生物有效性的同时，减少其潜在危险性，是实现基因及细胞治疗恶性肿瘤需要解决的问题。预防措施：1、人工调控：CAR表达人工调控基因表达是实现基因治疗的安全策略之一。当CAR-T细胞输入患者体内出现明显免疫损伤时，利用人工基因调控手段(如启动自杀基因)清除CAR-T细胞，可以防止严重不良事件的发生。为此，一些自杀基因系统引入了CAR-T细胞，以增加治疗的安全性。2、T细胞亚群/型选择：有证据表明效应记忆T细胞(TEM)在体外毒性方面优于中枢记忆T细胞(TCM)，但在体内TCM具有较强的抗肿瘤效应和建立免疫记忆潜能。CAR修饰的初始T细胞亚群/型也影响它们的体外扩增和体内治疗作用。CAR修饰的T细胞体外扩增时，CD4+T细胞与CD8+T细胞共同培养对细胞毒效应T细胞的大量制备有帮助；树突状细胞与T细胞共培养对幼稚T细胞到效应/记忆T细胞转化、细胞因子分泌(Th1/Th2)有重要作用。精确地分离和检测潜在最有效的T细胞亚群/型，用少量的细胞达到最佳的治疗效果，将会提高临床应用的安全性。3、共刺激分子的选择：因CAR细胞内信号区不同，共刺激分子激活T细胞产生的抗肿瘤效应也不同，有研究表明，CD137能提高T细胞存活和抵抗激活诱导性细胞凋亡(AICD)。因此，选择最佳的共刺激分子达到良好的抗肿瘤作用，又避免引起不必要的免疫损伤也是提高安全性的策略之一。CAR-T细胞肿瘤免疫治疗具有诱人的应用前景，国外正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究。目前各国科学家正在寻找肿瘤特异性抗原作为分子靶点和开发适合CAR的单链抗体；同时进一步优化CAR的结构，筛选良好治疗潜质的T细胞亚群/型，以提高其有效性和安全性。随着研究的不断深入，相信不久的将来CAR-T细胞会给肿瘤治疗带来新的希望。