细胞工程-动物细胞培养基本技术与原理

第二章动物细胞培养基本技术与原理细胞与组织培养（体外培养）(cellandtissueculture)：从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养动物细胞培养的主要领域及意义动物细胞的培养特性动物细胞培养的生存条件主要讲3方面问题：一、动物细胞培养的主要领域及意义单克隆抗体与现代医学动物胚胎孵育与畜牧业动物细胞培养与现代医药业动物克隆的广泛应用1.单克隆抗体技术与现代医学单克隆抗体技术步骤：*骨髓瘤细胞(myelomacell)特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合杂交瘤细胞(hybridomacell)。杂交瘤细胞的特性：*既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology)。单克隆抗体的特性：*具有高度的特异性、灵敏性与准确性应用：临床医学的疾病诊断。生产各种免疫疫苗。用于某些肿瘤的治疗。用于各种基础医学研究。2.胚胎孵育与畜牧业农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。体外受精：加快农畜良种化。利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生产性能优良的家畜。类型动物细胞培养的产物人疫苗小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、某些癌症动物疫苗口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病酶尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶激素促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素免疫调节因子白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子3.动物细胞规模化培养与现代医药治疗性抗体抗体药物4.动物克隆技术有益应用动物克隆技术的应用前景：（1）保存优良的动物品种（2）拯救濒临灭绝的珍惜动物（3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物（4）利用克隆技术生产人体器官二、动物细胞特性动物细胞在活体内的特性培养条件下动物细胞生长特性培养条件下动物细胞生理特性1.动物细胞在活体内的特性在活体内，动物细胞:分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。增殖分化活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。2.培养条件下动物细胞的生长特性离体培养的动物细胞可分为：贴壁依赖型(anchorage-dependent)非贴壁依赖型(anchorage-independent)兼性贴壁细胞1）贴壁依赖型简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。成纤维细胞型细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。游走细胞型在支持物上分散生长，不连接成片，细胞胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而方向不规则。在一定条件下，可转变为成纤维细胞型。多形性细胞型某些组织和细胞，如神经细胞，难以确定它们的稳定形态，可统归于多形细胞型。nervecell2）非贴壁依赖型也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。3）兼性贴壁细胞动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。4.培养条件下动物细胞的生理特点1）动物细胞的分裂周期长动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。2）接触抑制(contactinhibition)现象除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。3）有限细胞系和永久细胞系动物细胞离体培养起始物--原代培养（primaryculture）经继代培养后即成为有限细胞系(finitecellline)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(invitrotransformation)。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。4）动物细胞的环境敏感性动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。三、动物细胞的环境要求1.动物细胞培养的环境要求1）无污染环境2）温度昆虫细胞培养温度一般是25～28℃哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。3）pH动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。4）气体环境及溶氧一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。5）渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：培养基的渗透压维持细胞体内的渗透压维持大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。四、动物细胞培养基本概念和基本步骤:取材分离和组织消化细胞计数常用培养法细胞的常规检查细胞系与克隆动物细胞的大规模培养细胞的冻存与复苏一、基本概念（generalconcept）：细胞培养（cellculture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。二、取材、分离和组织消化(todrawthematerialsfromtissue，separation，digestion)（一）取材——获取组织原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。取材方法:处死动物→取出组织块，放入小烧杯中→用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎块，补加3~5mlHanks液，用吸管轻轻吹打；→低速离心，弃去上清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染）→对某些软组织碎组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。（二）组织消化(tissuedigestion)用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。1、常用消化液适用范围（1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。（2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。（3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作用特点及组织成分不同适当选用（4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。2、组织消化操作方法(tissuedigestionmethodofoperation)（1）胰蛋白酶消化(trypsindigestion)①将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入30~50倍体积的0.25%胰蛋白酶；②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。根据效果可中间更换消化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶）③Hanks液漂洗两次，每次2~3min；④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。如消化传代细胞，可与EDTA混用。（2）胶原酶消化(collagenaseenzymaticdigestion)①培养瓶中放入1~5mm3大小的碎组织块，加5ml2000u/ml的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5；②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次；③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或弃之不用）；④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次；⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。三、细胞计数(cellcounting)——计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用于培养液中细胞浓度的检查）①染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置2~3min；②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。④计算：细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。细胞接种浓度：3~10×105/ml四、常用培养法(generalcultivation)（一）组织块培养法(tissuepiececultivation)将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，贴附一段时间后，细胞从组织块长