细胞培养实验指导

第五章细胞培养实验实验一普通光学显微镜的结构和使用【实验目的】1.熟悉显微镜的结构和各部件性能。2.掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜的使用方法。【实验内容】1.显微镜成像原理（图1—1）标本（F1）置于聚光器与物镜之间，目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜。平行的光线自反射镜折射入聚光器，经聚光器集聚增强，照射在标本上。标本的像经物镜放大成像于F2处，像是倒像。目镜将此例像进一步放大，并成像于人眼的视网膜上(F3)（正像）。2.显微镜的结构1）机械部分（1）镜座：显微镜的基座。起稳定和支持整个镜身的作用。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造（图1—2）。（2）镜臂：支持镜筒和镜台。镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活图1-2光学显微镜结构示意图1.目镜2.镜筒3.物镜转换器4.物镜5.透光孔6.聚光器7.光圈8.反光镜9.粗调节器10.细调节器11.镜臂12.移片器13.载物台14.倾斜关节15.镜柱16.镜座17.照明图1-1显微镜成像原理动的关节叫倾斜关节，可使镜臂作适当倾斜，便于观察。镜筒倾斜式显微镜由于镜臂和镜柱连为一体，故无此关节。（3）镜筒：位于镜臂前方的圆筒，上端安装目镜，下端装有旋转盘。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类。（4）载物台：在镜筒下方，方形或圆形．放玻片标本用。载物台中央有一圆形通光孔，两旁备有一压片夹。有的载物台上装有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，用于固定标本片。移动器的一侧有两个旋钮，转动旋钮可使玻片前后左右移动。（5）物镜转换器：圆盘状，在镜筒下方，其上装有3—4个放大倍数不同的物镜。旋转物镜转换器可更换物镜。（6）聚焦调节器；为调节焦距之用。大旋钮为粗调节器，转动粗调节钮可使镜筒(或载物台)升降，调节焦距。旋转一周可使镜筒(或戴物台)升降10mm。一般用于低倍镜调焦。小旋钮为细调节器，转动细调节钮可使镜筒(或超物台)缓慢升降，每旋转一周约使镜筒(或载物台)升降0.1mm。适用于高倍镜、油镜或分辨物象清晰度调焦。2）照明部分（1）反光镜；载物台下方，一面为平面．一面为凹面。平面镜聚光力弱．适于强光源和平行光源。凹面镜聚光力强．适用于弱光源或散射光源。反射镜的方位可以随意调节。（2）聚光器：在载物台下方，由一组透镜组成，可使反射光线聚集于标本上。一般在镜柱一侧有一旋钮，可使聚光器升降，和物镜配合使用。（3）光圈：在集光器下方，由一组活动金属片组成，构成一个可开可缩的孔。在其外侧有一小柄，可以调节控制光线通过。在光圈的下方常装有滤光片架，可以放置不同颜色的滤光片。3）光学部分（1）目镜：短圆筒状，装在镜筒上端，其上刻有放大倍数，每台显微镜常备有3—4只放大倍数不同的目镜，如5×、10×、15×等。眼睛通过目镜观察物像。（2）物镜：装在物镜转换器上的一组镜头，一般有低倍镜、高倍镜、油镜三种。每个物镜上刻有相应的标记。低倍镜筒上刻有10×或15×等标志，高倍镜筒上刻有40×或45×标志。油镜上一般为100×。N.A.表示镜口率，镜口率反映镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。各种物镜的比较见表1-1注：分辨力用分辨率表示，指能把两个物点分开的最小距离。距离越近，其分辨率越高。显微镜的分辨力可用下列公式来计算：R＝0.61λ／N.A.（N.A.＝n•sinα/2）上式中R为分辨力，N．A．为镜口率，n为介质的折射率，sinα/2为透镜视锥半顶角的正弦，λ为光波波长。放大倍数的计算：实物放大倍效=物镜放大倍数×目镜放大倍数3.显微镜的使用方法1）低倍镜的使用检查：右手握镜臂，从镜箱内取出显微镜，左手托境座，轻轻放在实验桌上。先检查一下显微镜部件有无损坏，如发现有损坏或性能不良者，立即报告教师请求处理。(1)准备；转动粗调节钮，将镜筒略升高(或将载物台下降)使物镜与载物台距离略拉开。再旋转物镜转换器，将低倍镜对准裁物台中央的通光孔。(2)对光：打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，向目镜内观察，同时调节反光镜的方向，直到视野内光线明亮均匀为止。反光镜的平面镜易把其他景物映入视野，一般用凹面镜对光。(3)放标本片：标本片的盖片朝上。将标本片放到裁物台前方，然后推到物境下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。(4)调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节钮，使镜筒缓慢下降(或镜台上升)，大约低倍镜头与盖片间的距离约5mm时，再从目镜里观察视野，左手缓缓转动粗调节钮，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像为止。如物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像更加清晰。如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成：①转动调节钮太快，超过焦点。应按上述步骤重新调节焦距。②物镜没有对正，应对正后再观察。③标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。④光线太强，尤其观察比较透明的标本片或没有染色的标本时，应将光线调暗一些后，再现察。2）高倍镜的使用(1)依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。(2)将需要观察的部分移到视野的中央。(3)眼睛从例面注视物镜，用手移动转换器．换高倍镜。(4)眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动纫调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。如按上述操作仍看不到物像时，可能由下列原因造成：①观察的部分不在视野内，应在低倍镜下寻找到后再换高倍镜观察。②标本片放反了，应将标本片放正后，再按上述步骤操作。③焦距没调好，应仔细调节焦距。有的显微镜高倍镜与低倍镜不配套．从低倍镜转换高倍镜时，往往转不过来或损坏标本，如遇到这种情况，可把镜筒略升高(或载物台下降)，直接用高倍镜调焦。方法是：从侧面注视物镜，调节粗调节钮，使高倍镜头下降至与标本片最短距离，再观察目镜视野，缓慢调节细调节钮，使镜头缓缓上升，直至物像清晰为止。如需要更换标本片时，应该先把镜筒升高(或载物台下降)，然后把标本片移到载物台前方，再取下。3）油镜的使用(1)先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。(2)把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤重新操作。(3)找到物像后，再调节聚光器和光圈选择最适光线。(4)油镜使用完毕后，上升镜头约10mm，把镜头转到一边，用擦镜纸把镜头擦净。如仍擦不干净，可用擦镜纸蘸少许二甲苯轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦一遍。(5)有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许二甲苯，把油擦净。4）使用练习低倍镜使用练习：取一张A字片，用低倍镜观察。练习对光、调焦，并注意观察物像与玻片移动方向是否一致，镜下观察的字母是正像还是反像？高倍镜使用练习；取一张羊毛交叉片(染成红色)．先用低倍镜观察，找到羊毛交叉点，移到视野中央，换高倍镜观察。调节焦距，注意观察上下羊毛的清晰度。油镜使用练习：取一张人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再练习用油镜观察。注意比较三种物镜的放大倍数和分辨率有何不同。练习分辨红细胞、白细胞和淋巴细胞。练习擦洗油镜头和标本片。4.使用显微镜的注意事项(1)取显微镜时必须右手握住镜臂，左手托镜座，切勿一手斜提，前后晃动，以防镜头或其他零件跌落。(2)观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离，以免显微镜翻倒落地。(3)使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗、细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。(4)粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。(5)用单筒显微镜观察标本，应双眼同时降开，左眼观察物像，右限用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。(6)禁止随意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。(7)显微镜的光学部件不可用手指、纱布、手帕或其他租糙东西擦拭，以免磨损镜面。需要时只能用擦镜纸擦拭。(8)凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触．如不慎污染时，应立即擦干净。【思考题】1．为什么使用高倍镜或油镜时，必须从低倍镜开始？2．显微镜下看到的物像是正像还是反像?物像与玻片的移动方向有何关系？【作业】1．填图注明光学显微镜各部件的结构名称。2．怎样区分低倍镜、高倍镜和油镜?3．简述使用低倍镜、高倍镜和油镜的主要步骤。实验二倒置、荧光显微镜的原理和应用多年来，光学显微镜在细胞生物学研究领域中发挥了重要作用。随着现代生物学技术与光学显微镜技术的结合，进一步研制出了多种有特殊功能的光学显微镜，使光学显微镜的应用技术从单纯形态学研究扩展到动态研究细胞结构与功能关系的领域。常用的特殊显微镜有倒置相差显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜和微分干涉显微镜等。【实验目的】1.掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。2.熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。3.理解暗视野显微镜的原理、用途和使用方法。【实验用品】1.器材：倒置相差显微镜、荧光显微镜、吸水纸、载物片、盖玻片、擦镜纸等。2.试剂：培养细胞用液、吖啶橙荧光染料。3.材料：培养细胞。【实验内容】1.倒置相差显微镜1）成像原理波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中波长(及频率)的变化，表现为颜色的不同，振幅变化表现为明暗的不同，而相位变化人眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时，虽然细胞内部结构厚度不同，但波长和振幅几乎没有改变，只是相位有了差别，所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。相差显微镜利用光的衍射相干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件，在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用于观察无色透明活细胞中的细节。倒置显微镜的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，它们之间主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此，可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，用来观察培养的话细图2-1相差显微镜位相环合轴调整胞。2）使用方法：(1)首先将显微镜合轴。(2)把视野光圈开大至与聚光器光阑边缘一致。(3)将与物镜放大倍数一致的相板插入光路。(4)把调中目镜换入目镜筒中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰。(5)调节聚光器上的相环调中螺钮(注意不要旋动聚光器的调中钮)，使两个圆环图像重叠成同心圆状态。此时的相差装置就调节好了。换回目镜即可用于观察。注意：当换不同倍数的物镜时．都要选用相一致的相板和相环，并重新调中。否则，相差成像效果不佳。3）注意事项(1)载物片或培养瓶必须乎整、均匀不好。标本不能太厚．否则相差显微成像效果不佳。(2)标本要在有水的环境中(如培养瓶中有培养液)，要用水封片等，成像效果才明显。(3)裁物片、培养瓶的表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑．影响观察效果。(4)光路上最好加单色滤光片，如黄/绿色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。4）用途例置相差显微镜主要用于观察正在培养的活细胞的生活特性，如细胞的生长、运动、发育、分裂、分化、衰老、死亡过程中细胞形态及其内部结构的连续变化。与缩时连续摄影或摄像结合使用，可真实记录下这些渐变过程。比用定时染色、切片观察记录再拼接起来的方法要完整、准确、真实。5）示教内容观察倒置相差显微镜下的培养细胞，注意与普通显微镜下(可把培养瓶翻转过来将细胞面朝上观察)的相同标本进行比较。2.荧光显微镜荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光．再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。1）成像原理某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等．经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而