荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用

细胞遗传学课程论文题目：荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用姓名：秦冉学号：113160401荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用摘要:荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术。该技术因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。本文简要介绍了荧光原位杂交在染色体制片技术、探针类型及探针标记方法方面的发展，概述了荧光原位杂交技术在基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测等方面的应用。关键词：荧光原位杂交技术；染色体制片技术；探针标记方法；基因定位ThedevelopmentoffluorescenceinsituhybridizationanditsapplicationinplantAbstract:Fluorescenceinsituhybridization(FISH)isanonradioactiveinsituhybridizationtechniquedevelopedinthelate1980s.Becauseofitscharacteristics:highsensitivity,strongspecificity,accuratepositioning,fast,safeandeffective,itcanbeusedinmanyfields.ThispaperbrieflyintroducesthedevelopmentofFISHinplantincludingthechromosomaltechnique,probetypeandlabelingmethod,thensummarizestheapplicationofFISHingenemapping,identificationofthedistanthybridanddetectionofthealienchromatin,etc.Keywords:fluorescenceinsituhybridization;chromosomaltechnique;probemethod;genemapping前言荧光原位杂交技术是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术[1]。其基本原理为：根据核普酸碱基互补配对原则,使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交,然后用合适的检测方法将荧光信号检出,达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从Rayburn等[2]于1985年首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后，该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。主要是由于以下几方面的原因：①FISH的灵敏度接近同位素标记探针杂交[3-4]，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；②运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；③DNA序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中[5]；④探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；⑤荧光显微镜和数字成像系统在过去20多年中不断改进；⑥特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多2种探针混合运用情况下出现特异信号；⑦未标记的基因组DNA通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。来。FISH技术的程序较复杂，主要流程包括染色体标本的制备，探针的制备、纯化与检测，染色体与探针的变性，原位杂交，杂交后洗脱，杂交信号的检测和放大，荧光显微镜观察、照相。随着FISH技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA合成（PRINS）技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH以及近年来微阵列技术（Microarray）等。同时，原位杂交靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，提高了FISH技术的分辨率，即2个不同DNA探针能够被检测到的最小距离，由1Mb发展到1kb，这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。近二十年，随着该技术的不断发展，在植物的研究中已得到了广泛的应用，例如植物基因的染色体物理作图[6]，杂种中亲本染色体的鉴定[7]，外源染色体或染色体片段的检测[8]，物种进化及亲缘关系的探讨[9],转基因材料中外源基因的定位[10]。本文主要介绍了荧光原位杂交探针类型、探针标记方法的发展、染色体制片技术的发展等，综述了荧光原位杂交技术在植物分子细胞遗传学方面的应用与展望。1荧光原位杂交技术FISH的发展1.1染色体制片技术染色体是遗传物质的载体，植物染色体制片技术是细晌馈传学中最基本、最常用的方法，在物种亲缘关系鉴定、染色体变异、杂种分析等方面得到广汗应用。1.1.1预处理在制片预处理中中最常用的化学药品处理方法有:0.002mol/L的8-羟基唆琳在室温处理3~5h[11];其次是用饱和对二氯苯4℃处理1~2h[12]。此外还可0.1%~0.2%秋水仙素溶液室温处理2~3h[13]和放线菌酮溶液室温2.5~3.0h[14]。物理方法主要是对材料在0~8℃进行低温处理，最常用的是用冰水混合物对材料进行预处理12~36h。1.1.2固定常用卡诺氏固定液I（V无水乙醇醇：V冰酷酸=3:1）置4℃或常温对材料处理2~24h;也可用95%乙醇代替无水乙醇固定20~24h1.1.3解离解离常用方法有酸解法和酶解法。酸解法一般是将材料用1mol/L盐酸在60℃恒温软化细胞壁，依据材料不同，时间从数分钟到十几分钟不等[15-16]，也有3学者采用1mol/L盐酸与45%醋酸（体积比1:1）的混合液在370℃恒温水浴中解离45min。酶解法是用消化酶降解细胞壁，常采用纤维素酶（1~5%）和果胶酶（1~2%）混合液。酶解前需先将材料置于0.07smol/L的KCl溶液中低渗0.5~1.0h，然后加人酶液在25℃保温2~3h[17]或者37℃保温0.5~1.0h，用蒸馏水清洗后浸泡5~20min后进行低渗膨胀细胞，再用新鲜固定液固定30min[18]。1.1.4染色体制片方法染色体制片方法主要有常规压片法和去壁低渗法。压片法是植物染色体制片的常规方法，它简单且易操作，许多植物染色体核型分析、显带和原位杂交都是用这种方法完成的。有学者将经预处理的材料在卡诺固定液中固定后直接用45%的醋酸压片获得的染色体中期分裂相制片用于鉴定异源染色体片段的原位杂交，获得了较好的结果[19]。但这些方法成功率较低，主要是因为染色体很难完全散开，容易产生重盛、变形、断裂等，此外细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，使原位杂交的信噪比增高。具大染色体的植物材料如普通小麦可用上述方法制片，但具小染色体的植物材料不适用此方法，因为获得的制片很难区分染色体上的各个部位。去壁低渗火焰干燥制片法必须考虑几个重要因素如前低渗处理时间、混和酶液的浓度、酶解时间和酶解温度以及后低渗处理时间等。低渗的目的在于使细胞吸收水分而膨胀，染色体分散到细胞质中，在制片时便于染色体分散开，不同材料低渗的最佳时间不同，未经低渗处理的材料，细胞核膨胀的较小，染色体不易分开，而低渗处理过度，使细胞在低渗液中胀破，造成材料解体；酶解温度必须恒定，酶液浓度应控制在2%~5%，根尖材料为2.5%左右，树木幼叶、幼芽可用5%左右；此外，酶解时间是个变化的因素，要根据材料的不同做适当调整，材料过大，会使酶解时间成倍增加，材料过多，会导致消化不足，酶液量过多会使酶解时间不易稳定。去壁低渗法又分为：（1）涂片法:将材料放在预先洁净冷冻的载玻片上，加一滴固定液，然后用镊子取根尖分生区组织，迅速将材料敲碎涂抹，并去掉大块组织残渣。然后从载玻片一侧向材料轻轻吹气，使组织分散成一薄层，涂抹的载玻片可自然或加热干燥[20]。（2）悬液法:将材料用镊子夹碎、搅拌使其形成细胞悬液，然后将材料固定20min，视细胞沉淀后，用吸管轻轻地吸去上清液，留1mL左右细胞悬液制备染色体标本。用吸管滴2~3滴细胞悬液在洁净载玻片上，将载玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干或自然干燥[21]。1.1.5染色与观察染色体染色时常选用碱性染料，常用的染色体染色剂有:醋酸洋红、改良石炭酸品红（卡宝品红）、苏木精和吉姆萨等。在植物染色体制片中以改良石炭酸4品红染色效果最好，具有染色快、着色深、适应性广的特点，适合于多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色。染色后即可在显微镜下观察拍摄染色染色体相片。1.2靶DNA载体及FISH技术的改进1.2.1中期染色体在通常的原位杂交技术中，多以中期染色体（Metaphasechromosome）作为靶DNA的载体，此时期染色体可以通过简单的染色体制片技术获得,但因其高度凝缩,分辨率只能达到1~3Mb的水平。1.2.2减数分裂粗线期染色体由于中期染色体结构高度凝缩的影响，其分辨率只能达到1~3Mb的水平。然而这对于构建高分辨率的DNA物理图谱来说，1~3Mb的分辨率水平是还不够的，必须寻找分辨率更高的技术。而减数分裂的粗线期染色体（Pachytenechromosome）浓缩程度比中期染色体大为降低，其长度比相应的中期染色体大7~50倍，粗线期染色体FISH的分辨率可达100kb左右，而且Jiming等[22]人证实用玉米粗线期染色体固定于4%福尔马林可以使染色体伸长到原来的很多倍。粗线期染色体还具有可识别的结构特征，包括着丝粒位置、短臂和长臂的比例、异染色质和常染色质的形态等，另外，粗线期染色体所在几乎不存在细胞壁，染色体延展良好，且同源染色体配对提供了2个目标区域增加了一倍，以上这些特点说明了粗线期染色体可适用于原位杂交及物理作图。1.2.3间期细胞核FISH与分裂期的染色体相比，间期细胞核的染色体凝缩程度很低，FISH的分辨力可提高到50kb[23]。在人类间期核的FISH分析中发现，当2个探针的间距在100kb至2Mb时，间期FISH作图可用来测定染色体上2个相邻序列间的物理距离，不过，间期核缺乏可辨别的染色体结构，无法分辨单个的染色体，不能确定FISH信号相于着丝粒、端粒和其它染色体标记的位置；而且在不同的细胞类型和染色体区域，染色质的凝缩模式和程度不同，必须有相应的对照标准。这些不利因素限制了间期核FISH的应用。1.2.4Fiber-FISH近年来，利用间期核制备高度伸展的DNA纤维（ExtendedDNAfiber）作为FISH的模板，已将分辨率水平提高到与常规分子生物技术SouthernBlot分析相当的水平，在1Mb的范围内，Fiber-FISH分辨力达到1~2kb，灵敏度可达到＜700bp[24]。该技术首先在人类细胞中获得成功[25]。其基本原理是，首先将单细胞悬浮液涂在载片上，然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏，让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维，在这种纤维上进行原位杂交。利用这一项技术，可以开展YAC、BAC、黏粒、噬菌体和质粒DNA克隆在DNA纤维上的线性排列顺序并准确地构建出DNA物理图谱。51.2.5超伸展的流式分拣植物染色体FISH最近Valárik等[26]发展了一种超伸展的流式分拣植物染色体（Super-stretchedflow-sortedplantchromosome）高分辨FISH技术。流式分拣的大基因组（包括大麦、小麦、黑麦和鹰嘴豆）染色体在玻片上干燥后经温和的蛋白酶K消化和乙醇:冰醋酸（3:1）伸展，可获得比中期染色体长100倍以上的伸展的染色体纤维。由于这种超伸展的染色体之间不重叠，又保持了染色体的完整性，并有较大范围的伸展程度，可以用于研究染色体的超微结构，因此与Fiber-FISH技术相比具有一定的优势。此FISH技术特别适合于难以进行粗线期染色体FISH研究的大基因组。它的不足是需要用流式