萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究

萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究Enzymaticpropertiesofthediastasefromgerminantwheat专业：制药1201学号：A09120376姓名：杨田华萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究Enzymaticpropertiesofthediastasefromgerminantwheat杨田华A09120376东北农业大学生命科学学院摘要：酶的活性通常受温度，PH，以及激活剂和抑制剂的影响。淀粉酶能将淀粉水解，我们可以通过比较酶反应混合物遇到碘所呈现的颜色来判断以上因素对酶活性的影响，酶的催化活性受温度和PH的影响很大，通过实验的现象判定出酶的最适温度和PH，酶的激活剂能增强酶活性，抑制剂能使酶活性降低。由实验结果可得出:α-淀粉酶活性为264.7（麦芽糖mg•g‐1鲜重5min‐1），总淀粉酶活性为295.5（麦芽糖mg•g‐1鲜重5min‐1），酶的最适温度为40℃，最适PH为5.6左右，小麦淀粉酶的激活剂为Nacl，抑制剂为CuSO4。关键词：淀粉酶；酶活性；温度；PH值；激活剂和抑制剂前言：淀粉主要存在于植物中，是植物中最主要的储存多糖，尤其是在萌发后的禾谷类种子籽粒中淀粉酶活性更强。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖，麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可以从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。淀粉也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。α-淀粉酶是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一，目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖，等多种行业。1.材料与方法1.1.1实验材料萌发的小麦1.1.2主要仪器电子天平；研钵；离心机；试管；恒温水浴；冰箱。1.1.3主要试剂CuSO4溶液（0.3%）；碘液；NaCl溶液；磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；淀粉溶液。1.2方法1.2.1粗酶的提取称取2g萌发的小麦种子研磨成匀浆，倒入25ml具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，混匀后在室温下静置，每隔数分钟震荡一次，放置20分钟后，开始离心（4000r/min）10分钟，取上清液（即为淀粉酶粗酶液）备用。1.2.2淀粉酶活力测定取六支干净的试管，编号，按下表操作。操作项目α-淀粉酶活力测定总酶活力测定Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液/ml1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴15min，冷却淀粉酶稀释液ml0001.01.01.03,5-二硝基水杨酸/ml2.0002.000预保温将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min1%淀粉酶溶液/ml1.01.01.01.01.01.0保温在40℃恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸/ml02.02.002.02.0将各试管摇匀，分别取2ml，放入25ml刻度试管中，再加入2mlDNS试剂混匀，置于沸水浴中煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml混匀，在分光光度计上520nm进行比色测定光密度，记录测定结果。根据公式α-淀粉酶活性=[（A-A′）ⅹ样品稀释倍数ⅹ定容体积]/(样品重ⅹC)总淀粉酶活性=[（B-B′）ⅹ样品稀释倍数ⅹ定容体积]/（样品重ⅹC）A-α-淀粉酶生成的麦芽糖毫克数（标准曲线）A′-α-淀粉酶对照管B-总淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖毫克数（标准曲线）B′-总淀粉酶对照管C-比色时所用毫升数经计算可得：α-淀粉酶活性=264.7（麦芽糖mg•g‐1鲜重5min‐1）总淀粉酶活性=295.5（麦芽糖mg•g‐1鲜重5min‐1）2.1温度对淀粉酶活性的影响取8支试管编号，并记录观察到的颜色管号AaBbCcDd缓冲液（PH5.6）/ml1-1-1-1-淀粉溶液/ml2.5-2.5-2.5-2.5-淀粉酶提取液/ml-1-1-1-1预保温/10min4℃室温40℃沸水浴混合A倒入a中B倒入b中C倒入c中D倒入c中酶促反应（10min）4℃室温40℃沸水浴碘液各3滴（滴管应先冷却至室温）显色深蓝浅蓝无色浅蓝1.4℃：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉没有被水解，加入碘液后显示为蓝色2.室温：酶的活性受到了一定程度上的抑制，部分淀粉被水解，加入碘液后呈浅蓝色。3.40℃：酶的活性基本已经达到最大，淀粉几乎完全被水解，加入碘液后接近无色。4.沸水浴中，酶在高温中失活，淀粉也没有被水解，加入碘液后呈现蓝色。由此可以看出40℃是小麦淀粉酶的最适温度2.2PH对淀粉酶活性的影响取三支试管，编号，并记录观察到的颜色管号ⅠⅡⅢ缓冲液/ml2（PH3.0）2（PH5.6）2(PH8.0)淀粉溶液/ml各2.5淀粉酶提取液/ml各1酶促反应（10min）摇匀，40℃水浴10min碘液各3滴显色深蓝无色浅蓝1.PH=3.0，淀粉酶在强酸中完全失去活性，淀粉没有被水解，加入碘液后呈深蓝色2.PH=5.6，淀粉酶的活性最强，淀粉几乎完全被水解，加入碘液后没有颜色3.PH=8.0，淀粉酶在这个环境中活性受到抑制，但是还是有少量被水解，加入碘液后为浅蓝色。由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH2.3激活剂和抑制剂对酶活性的影响取四支试管编号，并记录观察到的颜色管号1234缓冲液（PH5.6）/ml各2---NaCl溶液/ml1CuSO4溶液/ml1NaSO4溶液/ml1H2O1淀粉溶液/ml各2.5淀粉酶提取液/ml各1酶促反应（10min）摇匀，40℃水浴10min碘液各1滴显色无色深蓝无色无色1.加入水和NaSO4都是空白对照组，加入碘液之后都是无色2.加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色3.加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂3.讨论1、温度、环境PH值、激活剂、抑制剂是影响酶活性的几个重要因素，研究其中一个因素对酶活性的影响时，要控制其他因素不变（其他因素尽量控制在使酶活性最高的水平上），从而研究这一单一因素对酶活性的影响。通过对淀粉酶活性初步研究得出结论如下：温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱。通过与他人的实验结果比较发现，该实验容易出现个体偏差。实验耗时长短结果会有偏差。萌发天数不同的材料，糖化时间不同。春季与冬季测定的结果有较大差异。估计酶的性质可能受多种因素影响。、通过对淀粉酶活性初步研究,说明温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱[3]3、研究酶有重要的意义。生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一,催化各种生化反应,是生物催化剂;其二,调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性;另一种是通过影响酶分子的合成和降解,以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节[4]现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[5]对于酶活力测定的方法有很多,比如测定酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法[3],该法建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α-淀粉酶活性的方法,此法的实验条件容易控制,重复性好。组织印渍法在玉米种子吸水约5h后即可检测到α-淀粉酶活性;再如2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷作底物直接测定α-淀粉酶法,该法用新底物2－氯－4－硝基苯－α－半乳糖－麦芽糖苷（Gal－G2－α－CNP）直接测定α－淀粉酶，不需要辅助酶，延滞时间短（＜15s），线性范围宽（可达2200U／L），试剂稳定性好，不使用KSCN、NaN3等激活剂，不受内源性葡萄糖苷酶的干扰，与EPS法对比相关良好[6][参考文献][1]王林嵩．生物化学实验技术[M]．北京：科学出版社，2001，29—32．[2]刘春莉,张文学,江孝明,杨瑞.新型耐酸性液化糖化酶的分离提取及其特性[J];酿酒;2003年03期[3]胡琼英，狄洌等．生物化学实验[M]．北京：化学工业出版社，2007，24—26[4]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学（下）.北京：高等教育出版社，2002，543[5]罗贯民，曹淑桂等．酶工程[M]．北京：中国农业出版社，2000，1—4．[6]李勇.2-氯-4-硝基苯-D-葡萄糖苷合成方法的研究[D]南京理工大学,2004