现代分子生物学第5章.

第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。P166基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。P166P166(一)工具酶1.限制性内切核酸酶P157/166能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。P157/168EcoRV2.T4DNA连接酶•从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离，它是T4噬菌体基因的产物，由一条多肽组成，分子量为68KD。•催化两条DNA链的3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体T4DNA连接酶催化反应条件•必须存在Mg2+和ATP。•最佳pH为7.5—7.6；温度在37℃时酶活力最高，5℃以下活力显著降低。•由于同时必须考虑DNA的稳定性和粘性末端的退火温度，在进行连接反应时的温度，对平齐末端连接—般采用20一25℃，对粘性末端连接则采用12℃左右。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。（二）基因克隆的载体P158/167具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。（二）基因克隆的载体大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体•低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。•长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体•松弛型复制控制的多拷贝质粒。•一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。•而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。AmpR优点是具有较小的分子量，其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：(1)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(2)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；(3)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；(4)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ’基因的功能。优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。5、pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。•SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向转录；•（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。•f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。P160/172图5-5重组DNA操作过程示意图获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-5）。P171重组DNA（基因工程/分子克隆）的主要步骤•包括以下四个基本步骤•(1)目的基因的获得；•(2)目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体；•(3)将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制；•(4)重组体分子的转化子克隆的选择和筛选图5-5重组DNA操作过程示意图(a)5.2DNA操作技术5.2.1核酸凝胶电泳P173自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。P173生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力P174凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。图5-6DNA脉冲电场凝胶电泳示意图P1745.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖P175细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。在基因克隆中，通常要通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。P175为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。常用的方法：P175–CaCl2法–电击法基因工程中常用α-互补来筛选重组质粒(蓝白斑筛选重组子的分子机制)，请说明其原理。•很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α-肽，载体转化的宿主细胞为lacZ基因型，它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β-半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为蓝色化合物，这就是所谓的α-互补，而重组子由于基因插入使α-肽基因失活，不能形成α-互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落。P163/175最后一段P165/177图5.2.3P1775.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，因此也称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的DNA或某一特定的DNA片段扩增十万乃到上千万倍，无需通过繁琐的基因克降测序，便可得到足够数量的精确的DNA拷贝，因此也被称为无细胞分子克隆。5.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomicPCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。（P165/177）P165/177图5-9聚合酶链式反应（PCR）技术原理示意图P177图5-10PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较P17894℃加热，淬火降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。50℃~60℃，退火引物与模板DNA相结合将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。PCR扩增，72℃左右,按每分钟1000个碱