抗体的选择2.

抗体的选择其木格2010.10主要内容基础概念如何选择二抗标记物的选择涉及的试验概念1.抗体（antibody,Ab）功能性概念是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。2.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）结构性概念具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。抗体的分子结构轻链：VL、CL重链：VHCH1、CH2、CH3、CH4IgGIgMIgAIgEIgD二、免疫球蛋白的功能区功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的功能特性。1.类和亚类（根据H链的抗原性不同）IgG—γ(gamma)IgA—α(alpha)IgM—μ(mu)IgD—δ(delta)IgE—ε(epsilon)(1)类(2)亚类IgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4IgA：IgA1,IgA2主要功能1.VL和VH是抗原结合的部位（FV区）。2.CL和CH上具有同种异型的遗传标记。3.IgG的CH2和IgM的CH3具有补体固有成分C1q的结合点，参与激活补体系统。4.CH3/CH4具有结合包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞等细胞的Fc段受体的功能。5.IgG的CH2+CH3具有介导IgG通过胎盘的特性。三、免疫球蛋白的水解片段1.木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断）Fab段（fragmentofantigen-binding，抗原结合片段）Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。Fc段（fragmentcrystalizable，可结晶片段）Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物学功能。2.胃蛋白酶（Pepsin）（将重链于近羧基端切断）F(ab′)2：可结合2个抗原表位。pFc′：无生物学活性。什么是一抗二抗？一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。如何选择二抗？检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，其中如何根据一抗的种属来源和类型选择二抗尤为重要。1、一抗的种属来源：二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。1、一抗的种属来源：常用的二抗产品包括：抗小鼠二抗（anti-mouse）、抗兔二抗（anti-rabbit）、抗山羊二抗（anti-goat）、抗绵羊二抗（anti-sheep）、抗人二抗（anti-human）、抗豚鼠二抗（anti-guineapig）抗大鼠二抗（anti-rat）、抗猪二抗（anti-swine）、抗马二抗（anti-horse）、抗牛二抗（anti-bovine）、抗鸡二抗（anti-chicken）、抗鸭二抗（anti-duck）等。2、一抗的类别亚型：除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。2、一抗的类别亚型：单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。2、一抗的类别亚型：在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。这类型的二抗有通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的AntiIgM（mu）Antibody、IgA的AntiIgA（alpha）Antibody、IgE的AntiIgE（epsilon）Antibody等。•由于在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，因此除了需要考虑一抗的种属及类型外，还需要根据后继的检测方案选择不同标记的二抗，因此需要对二抗的标记物进行选择。•按照标记分，有HRP、AP、生物素等标记二抗，FITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等荧光二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2等不同类型抗体。3、二抗的种属来源•一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。4、二抗的耦联标记•一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶、荧光基团、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于WesternBlot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin（生物素-亲和素）检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。5、是否经过血清吸附过的二抗•为减少二抗与样本的非特异性结合，需使用不同血清吸附的二抗。如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果对实验的特异性要求很高，推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。6、Anti-IgG还是Anti-IgG,F（ab’）2fragment•在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG,F（ab’）2fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG（H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG（H+L）与它们都有交叉反应。•而Anti-IgG,F（ab’）2fragment经过了IgGFc片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此与它们也有交叉反应。7、Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG（gamma）、Anti-IgM（mu）、Anti-IgA（alpha）•在一些特殊的实验里，只需要检测样本里的IgG或者IgM，常规的Anti-IgG（H+L）由于与IgG的重链和轻链都有结合反应，而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM。这时候就需要针对特殊类型Ig分子的二抗。如KPL的Anti-IgG（gamma）二抗是由Anti-IgG（H+L）与IgM、IgA等吸附后的二抗，消除了能与后者结合的部分。偶联到二抗上的探针种类二抗探针酶辣根过氧化酶HRP碱性磷酸酶AP其衍生物APAAP，PAP生物素卵白素荧光基团FITC,RRX,TR,PE,RhodamineWesternBlotELISA细胞免疫化学组织免疫化学流式细胞术常见二抗的应用WesternBlot组织免疫化学•HRP和AP是酶，二抗上挂了酶，要给相应的底物才能显色，显色方式可以通过发荧光也可以不发荧光（例如给予ECL底物，其中的H2O2和鲁米诺在HRP的作用下，能在黑暗中发出荧光；也可以给予双氧水和DAB，反应产生棕色不溶于水的物质）。•荧光标记物如FITC为异硫氰酸荧光素，本身就是黄绿色荧光，二抗结合后可直接在荧光显微镜下观察；生物素一般也是挂在二抗上的，利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，这个终产物也是不溶于水的。酶•主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化、westernblot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和westernblot.异硫氰酸荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明菁类染料藻红蛋白或藻胆色素蛋白ACMA荧光基团异硫氰酸荧光素•异硫氰酸荧光素-FluoresceinIsothiocyanate（FITC）荧光标记二抗•FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、TexasRed等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。四甲基异硫氰酸罗丹明•四甲基异硫氰酸罗丹明-TetramethylRhodaminIsothiocyanate（TRITC），RhodamineRed-X（RRX）,TexasRed（TR）荧光标记二抗•这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长（550,570,596nm）和最大发射波长（570,590,620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。四甲基异硫氰酸罗丹明•在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2（FITC）,RRX和Cy5的理想激发波长。四甲基异硫氰酸罗丹明•因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发,在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。1Cy22Cy33Cy5菁类染料Cyaninedyes菁类染料菁类染料•Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。菁类染料•Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更