影响体外受精效果的因素

影响体外受精效果的因素历史与背景•1878年，德国科学家Schenk将体内成熟的家兔和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体排出和卵裂现象。•1944年，Pock和Menkin进行人卵的体外受精实验。•1945年，美籍华人张明觉成功进行了兔的体外受精实验。•1959年，美籍华人张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批体外受精的试管小兔。IVF的意义1.可利用屠宰场的卵巢生产大量价廉质优的胚胎，可解决胚胎移植的胚胎来源问题。2.可使因生殖道疾病而无繁殖能力的优良母牛仍能繁殖一定数量的后代。3.可结合活体采卵技术，充分发挥优良母牛的繁殖潜力。4.可开发利用大量的腔前卵母细胞，进一步挖掘良种母牛的繁殖潜力。IVF的意义5.可使未成熟的牛犊繁殖后代，大大缩短育种的世代间隔。6.可结合精子分离技术生产预知性别的胚胎，达到了控制性别的目的。7.可为核移植和基因转移提供丰富的实验材料和必要的辅助手段，加速其研究的进展。8.可作研究的手段，加深人们对卵母细胞发生与成熟，精子的获能与受精以及胚胎的早期发生等理论问题的认识.体外受精技术由卵母细胞成熟精子获能受精受精卵体外培养胚胎移植程序组成的完整系统.精子获能capacitation一般认为，雄性动物产生的精子必须在雌性生殖道内停留一定的时间，发生一定的生理变化后才能具备受精能力。此过程称为精子获能。精子的获能过程是多时相，多步骤的复杂过程。获能阶段第一阶段：获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子，增强了膜通透性。此过程在一定程度是可逆。第二阶段：是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。此过程是不可逆的结构上的获能。精子获能方法有两种：即体内获能和体外获能。休内获能是从交配母畜的子宫内冲取精子用于受精。体外获能分两步：一：精子洗涤。离心以除去杂质，精清，死精子，低活力的精子，冻精保护液及稀释液。二：获能处理，主要是使用离子强度液（His)，钙离子载体，肝素（10—100ug/ml,15min)等。精子体外获能的主要方法1)高渗溶液处理法：受精前用360mOm的高渗溶液处理精子30分钟，然后进行受精。2)肝素处理法：用含100mg/ml肝素的受精液。3)用Ca2+载体A23187提高精子内部Ca2+的浓度。4)与血清白蛋白的溶液长时间孵育5)与含有卵泡液的培养液进行孵育体外受精的培养系统目前通常采用的受精系统由微滴法和微孔板法。1.微滴法：液滴体积通常为30～50ml，上覆石蜡油。该法的优点是受精效果好，精子利用率高；缺点是需用石蜡油，比较麻烦。2.微孔板法：受精液体积通常为0.5～0.8ml，上覆石蜡油或不加石蜡油。该法的优点是操作简单，一次可受精大量的卵子；缺点是精子的利用率相对较低，受精后的胚胎发育率也不如微滴法好。卵母细胞体外受精的评定体外培养：受精后48小时可检查其受精分裂率，体外培养7天后检查囊胚发育率，培养9天后，检查囊胚的孵化率。卵子体外受精的影响因素精子的来源1.取自附睾的精子比体外采集的精子容易在体外诱发获能，故通常可获得较高的受精率。2.来自不同公畜的精液在活力、获能及顶体反应的难易程度上均存在明显差异。3.不同公畜个体精子的受精分裂率有差异，但其胚胎发育率的差异则更为明显。4.同一公畜个体在不同季节采集的精液，其体外受精效果无明显差异。受精滴中精子不同平衡时间以加入精子时间为0h(对照组),分别在0h,0.5h,1h,2h,4h随机加入等数卵母细胞到各受精滴,结果显示:0h,0.5h组卵裂率较高,分别为87.7%、84.7%,与其他组相比差异显著(P0.01);0.5h组的囊胚率最高,为67.5%,与对照组的57.7%比较差异显著(P0.01)。结果表明,受精滴中精子经过0.5h平衡后,弱精及死精粘聚沉淀,余下活力强的健壮精子,此时加入牛卵母细胞受精,可获得较高卵裂率及囊胚率。(文国艺,阳年生;1999年月11月)受精液及其成分受精液必须有利于精子的获能和卵子第二次成熟分裂的完成。故通常为成分较为简单的生理盐溶液。最为常用受精液通常为TALP和BO，其渗透压一般为285～295mosm，内含10mM的乳酸钠、1mM的丙酮酸钠和2mM的Ca2+，其中Ca2+起关键作用。BO液中的NaHCO3浓度高达35.7mM，不含Hepes，主要用于用A23187作为获能剂的受精液。TALP的NaHCO3浓度通常为25～30mM，内含5～10mM的Hepes，主要用于用肝素作为获能剂的受精液。受精用液种类的影响应用改良Tyrode’s液(简称T，对照组)与0.6%BSA-TCM199(简称BT)作为受精液〔实验1)、这两种受精液的不同配比作为受精液(T，BT分别为3:1、l:1和1:3，T为对照组，实验2)和在不同受精时间采用不同受精液(先用T，IVF24h后改用BT或TCM199+10%发情牛血清，实验3)，对经体外成熟培养后的牛卵母IVF效果的影响。结果，应用成分复杂的BT作为受精液，可以提高受精卵体外囊胚发育率结果说明，在现行使用的、成分简单的改良Tyrode’s受精液中，添加一定浓度(25%~50%)含0.6%BSA的TCM199，作为IVM后的牛卵母细胞体外受精液，可以明显提高体外受精的质量，从而提高胚胎的最终产量。(谭世俭，卢克焕，1994年6月）受精液中肝素和咖啡因的组合采用2种肝素浓度(10，30mg/L)与3种咖啡因浓度(2.5，5，10mmol/L)的交叉组合，以30mg/L肝素的受精液为对照，探讨肝素和咖啡因对牛卵母细胞体外受精的影响，并确定受精后将卵母细胞移至单层细胞的合适时间。结果表明，当卵母细胞在受精后5h移至单层细胞时，10mg/L肝素加5mmol/L咖啡因或30mg/L肝素加2.5mmol/L咖啡因的体外受精效果最好.(文国艺,卢克焕;1994)BOEC+CCS、TAUTIN(输卵管上皮细胞+颗粒细胞,牛磺酸)在受精液添加BOEC+CCS后,能显著提高体外受精率。这可能是添加BOEC+CCS能模拟输卵管内环境,从而改善受精环境,增强精子活力,并能够清除代谢垃圾。SNandi等(1998)将刚射出的牛精子与BOEC共培养了6小时,发现精子的获能明显增加。Ｎ.Ｓ.Martus等(1998)从输卵管液中分离到了输卵管糖蛋白,并证明它在牛的体外受精中能显著提高受精率。卵丘细胞在卵母细胞体外成熟阶段，卵母细胞周围的卵丘细胞数量的多少，对其随后的受精和卵裂以及胚胎发育均有很大的影响。然而，在受精阶段，卵母细胞周围的卵丘细胞存在与否，对其随后的受精及卵裂无关重要。(杨膺白,卢克焕,1994)温度在一定温度范围内,受精温度的升高,精子对卵母细胞的穿透率也相应提高(Lenz,1982;Ball等,1984)。在37～39℃范围,体外受精温度对牛卵母细胞受精率及卵裂率无明显影响,但对受精卵的囊胚发育率及孵化率有明显影响(谭世俭等,1983)。本研究将体外受精的温度设定为37、38、39℃时,体外受精温度对延边黄牛受精卵的卵裂率无明显差,39℃为受精卵的最佳体外发育温度。冷冻条件(温度)比较了乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(G)和不同的投液氮温度(-33℃或-40℃),对牛体外受精卵冷冻后发育率的影响。结果表明:投液氮温度以-40℃为较好,防冻剂以EG的冷冻效果为最佳。玻璃化冷冻法完全可以应用于冷冻牛体外受精卵。(黄凤玲,石德顺,卢克焕;2002)体细胞因子•精子的获能和受精是在输卵管中完成的，因此，输卵管上皮细胞的分泌因子可能对精子的获能和受精具有促进作用。体细胞因子BFF(牛卵泡液)对牛卵母细胞的体外受精具抑制作用，而内膜细胞的条件液则具促进效应。BFF的这种受精抑制因子可能来自血清而不是卵泡细胞。(石德顺,卢克焕,1994)水质•水质对体外受精的成功与否至关重要。Bavister（1988）发现，培养液在贮存过程中，CO2和碳酸盐流失，致使pH升高，对精卵产生有害的影响。我们的研究发现，水源质量对IVF有明显影响，在受精液中加入50mM的EDTA，可除去重金属离子，降低水质对IVF的影响精卵比率精子的浓度过高易引起多精子受精，过低又影响受精率。通常用于体外受精的精子浓度为1.0~5.0×106/ml，精卵比率为10000~20000:1。在有咖啡因存在的条件下，精子浓度可降低为0.5×106/ml，精卵比率可降低为500~2000:1。温度牛体外受精的最适温度是39℃，如果采用37℃，受精率则下降15%以上（Sharif，1992）。Cheng等（1986）对猪的体外受精亦发现，37℃时的受精率不到1%，而39℃时则达39%。Watson等（1991）发现羊精子的顶体反应也与温度显著相关。气相环境通常采用含5%CO2的空气。虽然胚胎的体外培养采用5%CO2，5%O2和90%N2的气相环境培养效果较好，但体外受精效果则不如含5%CO2的空气。其主要原因是精子在获能过程中呼吸增加，耗氧量增加2~3倍，过低的氧浓度将不利于精子的获能与受精。精卵孵育时间•当采用A23187获能处理精子，或受精液中的咖啡因浓度在5mM以上时，精卵孵育时间应控制在6~8小时。•当用肝素获能处理精子，且受精液中的咖啡因浓度为2.5mM时，精卵孵育时间应控制在24小时以内，因咖啡因对卵母细胞受精后的胚胎发育具有抑制作用。咖啡因预处理用2.5mM咖啡因处理解冻牛精液10min.或5.0mM咖啡因处理30min.，精子经离心后加入到不含咖啡因的受精液中进行体外受精，均获得较高卵裂率(分别为89.1%、89.9%)及囊胚率(分别为4.4%、45.9%)，并且第7天一级囊胚数较多。(文国艺，2000）牛血清白蛋白一般认为添加血清与激素，是使卵母细胞周围的卵丘细胞充分扩展的必要因素，而且卵丘细胞的扩展程度与核成熟密切相关。(1)、在体外成熟阶段，有、无血清，对牛卵母细胞的核成熟及随后的分裂率无显著影响，但对随后的早期胚胎有显著影响。(2)、血清对牛卵母细胞的体外受精、早期胚胎的体外发育至关重要，且对后者更为重要。（陈鸿冰，卢克焕；1994）血小板激活因子（Plateletactivationfactor,PAF）•PAF是一种与磷脂相联的酯，具有诱发质膜囊泡化的特性，且是精子顶体反应的内源诱导者。•在受精液中加入100ng/ml的PAF能显著提高牛卵母细胞受精后的囊胚发育率。血管内皮生长因子人的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF),具有能诱使细胞质与核的成熟的作用。在牛的IVM/IVF/IVC培养液中分别添加不同剂量的VEGF后，5ng/ml的处理组得到最高发育到4-8细胞的胚胎(42%以上)。Einspanier等认为，VEGF也是影响卵母细胞成熟和胚胎质量的一个重要因子。氨基酸大部分氨基酸对卵母细胞的体外受精具有能抑制作用，但个别氨基酸则对体外受精具有促进作用。（甘、丝、天冬、丙、谷氨酰胺，具促进作用；苯丙、缬、异亮、色、酪AA，则抑制胚胎的发育）存在的问题与对策目前存在的主要问题是受精后的胚胎发育率偏低，胚胎的质量较差。解决这些问题可从如下几方面考虑。常规成熟培养的策略•体外成熟培养的系统应有利于维持卵母细胞在体外的活力。•成熟培养的条件应有利于成熟分裂的恢复和完成。•成熟培养条件应有利于卵母细胞质成熟的最后完成。提高卵母细胞成熟前质量卵泡的大小是卵母细胞成熟前质量的重要标志。如用促性腺激素对采卵前的动物进行处理，增加卵巢上面的大卵泡数量，将完全可能提高卵母细胞体外成熟的效果。延长成熟培养时间•使用cAMP等控制卵母细胞的核成熟，延长成熟培养的时间，使卵母细胞质得以充分成熟。你已到了终点站!