发酵工程(李艳)

三、萃取（extraction）分离利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：1）比化学沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快3）比蒸馏法能耗低（一）溶剂萃取法明确几个概念：料液：供提取的溶液。溶质：料液中欲提取的物质。萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂。萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液。萃余液：被萃取出溶质后的料液。反萃取（backextraction）：完成萃取操作后，将产物从有机相转入水相的萃取操作。溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律）为基础。在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。K0值随溶液pH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，因为:1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。萃取操作的3个步骤：1）混合2）分离3）溶剂回收课件图示单级萃取流程（二）双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。双水相的形成：两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。Powerpoint附PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图、葡聚糖和甲基纤维素钠的两项体系几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖（Dex）、羟丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素聚乙二醇（PEG）磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁2.萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。当生物分子进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用及各种力（疏水键、氢键、离子键等）的存在，使其在上相和下相之间按其分配系数进行选择性分配。分离物质的分配系数与浓度无关，而与被分离物质本身性质及其特定的双水相体系的性质相关。3.应用胞内酶的提取和精制:除去细胞碎片，并使酶得到纯化。几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐β-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐（三）超临界流体萃取兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体(supercriticalfluid，SCF)：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。(附图示物质的超临界状态)临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。SCF性质介于液体和气体之间：1)SCF密度接近于液体，溶解度高。2)SCF粘度和扩散系数接近于气体，传质扩散快。基本过程：1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。2）降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为：1）液体CO2无毒2）临界温度（304.06K）接近常温3）临界压力（7.38MPa）较低4）操作安全超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用CO2萃取部分产品原料名称产物名称原料名称产物名称小麦胚芽胚芽油豆子豆油精炼油啤酒花啤酒花精油茉莉花净油辣椒辣椒红色素菊花根除虫菊酯当归精油紫草紫草宁银杏叶银杏内酯花生精炼油（四）反胶团萃取1.反胶团：又称反胶束（ReversedMicelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。2.萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。课件附图反胶团萃取原理3.表面活性剂及有机溶剂反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂（1）表面活性剂常用：AOT(AerosolOT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。（2）非极性有机溶剂环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。4.优点1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。四、膜分离借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。（一）扩散膜分离——透析（图示蛋白质透析装置和透析过程示意图）溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动，浓度差作为推动力1.透析膜材料：纤维素衍生物、纤维素酯膜。1）透析膜的预处理：(P162)使用前，先用50%的乙醇慢慢煮沸1h,再分别用50%的乙醇，0.01mol/lNaHCO3、0.01mol/lEDTA依次洗涤，最后用蒸馏水洗三次。目的：除杂质。2）透析袋的保存：湿润型或用过的透析袋用1%苯甲酸钠或0.05%叠氮钠或50%乙醇防腐，于冷柜中保存。2.透析方法及装置透析袋透析简单装置（附图）A:透析夹，B:透析，C:透析示意图（二）加压膜分离静压力差为推动力。根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：微滤、超滤、反渗透。（课件附表）微滤(Microfiltration，MF)：（附图）一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；超滤(ultrafiltration，UF)：（附图）一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。1）利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。2）超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。图示：常规过滤(A)和超滤(B)的示意图、超滤浓缩装置反渗透（Reverseosmosis，RO）：（附图）利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。图示：渗透与反渗透比较（三）电场膜分离电位差为推动力（1）电渗析：在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场的作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，达到分离的目的。（2）离子交换膜电渗析：用离子交换膜代替一般的半透膜。离子交换膜带有某种基团，只让戴一种电荷的颗粒通过。选择透过性强。应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。第十四章发酵产物的纯化原理与技术一、酶的浓缩浓缩方法很多，前面所述的离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离都能起到浓缩的作用，介绍常用的几种浓缩方法。(一)蒸发浓缩图4-60减压蒸发浓缩的简易装置由于酶液在高温下不稳定，所以酶液的蒸发浓缩用真空浓缩，即在密闭的容器中用抽气减压装置维持一定的真空度，使酶液在600C以下的温度沸腾蒸发。实验室：旋转减压蒸发仪，操作时，一边加热，一边抽真空，利用减压条件下溶液沸点降低的原理，使溶液在较低温度下沸腾蒸发，达到浓缩目的。工业上：薄膜蒸发皿，在高度真空条件下，使酶液变为极薄的液膜，蒸发面积增大，与大面积热空气接触，水分瞬时蒸发而达到蒸发的目的，酶较少失活，可连续操作。（二）超滤浓缩超滤(ultrafiltration)：浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。优点：没有热破坏、没有相变化、保持原来的离子强度和PH值、如果膜选择适当，还可同时进行粗分。（三）吸水剂1.胶过滤浓缩：利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。2.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。上述两法成本高，只适于实验室少量样品。（四）反复冻融浓缩原理：溶液相对纯水，会发生溶点升高，冰点降低的现象。操作：可将溶液冻成冰块，然后使之缓慢溶解，不含蛋白质和酶的冰块漂浮于液面，而酶等溶解并集中于下层溶液，移去冰块。（五）沉淀法盐析法，有机溶剂法二、酶的干燥酶的干燥多采用冷冻干燥法。将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。三、酶的结晶结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。晶体内部有规律的结构决定了晶体的形成必须是相同的原子、离子或分子。过饱和溶液的形成是结晶的原推动力和首要条件。（一）结晶的条件1.酶的纯度纯度越高越易结晶（50％）。酶的结晶并非达到绝对纯化，而是达到相对的纯度，要获得更纯的酶一般要多次重结晶。2.酶的浓度（恰到好处）浓度越高越易结晶，因为高浓度的蛋白质分子扩散速度慢，相互碰撞聚合的机率也大，要获得良好的结晶一般将溶液浓度控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。浓度过大形成很多小晶核。不宜长大（大量微晶）（恰到好处）3.结晶温度：低温有利晶体析出，且有利于保护酶活。温度升高，溶解度升高，可将结晶的物质在高温下溶解，使其达到饱和状态。然后在低温下结晶。4.溶液pH：远离酶的等电点不利于晶体的形成。5.离子强度：某些二价金属离子能促进晶体的长大，如硫酸铵溶液中进行铁蛋白的结晶加入少量镉离子能形成菱形结晶。6.晶核：晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消耗一定的能量。当能量在某一瞬间、某一区域由于布朗运动暂时达到较高值时，会析出微小颗粒，即结晶中心称晶核，晶核不断生长形成晶体。7.结晶时间（二）结晶的方法1.除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体;2.不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。常用的结晶方法：透析平衡结晶法，将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。补充一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异1.调节溶解度：沉淀法2.根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤3.根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳4.根据专一性结合的方法：亲和层析5.其它：吸附层析，疏水层析（二）纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。二、纯化方案的评价（一）酶活力测定：P42酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率。方法：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。常用的方法：1.化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。2.分光光度法：