吉林大学植科院2013级生化笔记总结

赤藓糖葡萄糖甘油醛核糖甘露糖半乳糖(Gal)（（Gal）二羟基丙酮核酮糖木酮糖果糖讲一生物大分子：糖、脂、蛋白质（酶）、核酸、维生素、激素生物化学之父：费舍尔讲二地球上数量最多的一类有机化合物：糖类α和β吡喃葡萄糖（羟基在下为α型，在上为β型）糖原高度分支的生理意义：第三章、蛋白质20种氨基酸英文名等电点掌握氨基酸的用途、现象DNFB法PITCCys半胱氨酸Ellman反应，DTNB，二硫硝基苯甲酸Ellman反应（二硫硝基苯甲酸，DTNB）Cys与二硫硝基苯甲酸(DTNB)或称Ellman试剂发生硫醇-二硫化物交换反应。反应中1分子的Cys引起1分子的硫硝基苯甲酸的释放。它在pH8.0时,在412nm波长处有强烈的光吸收,因此可利用分光光度法定量测定-SH。肽平面（酰胺平面）——由肽键周围的6个原子组成的刚性平面3.6蛋白质的纯化注：用尽可能少的步骤、尽可能短的时间。1.前处理阶段物理法——冻融法，超声波法，均浆法，研磨法等。酶裂解法——就是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化的方法，常用的水解酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶、壳多糖酶、细胞壁溶解酶等。其中溶菌酶主要对细菌类有作用，其他酶对酵母作用显著。2.粗分级/粗分离根据蛋白质的①溶解性质、②大小不同、③带电状态不同/电荷多少④净化方法根据与其他化合物相互作用的蛋白质（部分蛋白质对..有特定的..）②：凝胶过滤层析常用凝胶过滤介质Sephadex：交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。高交联度的Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。Sephacryl:烯丙基葡聚糖同N、Nˊ—甲叉双丙烯酰胺共价交联而成。颗粒坚硬，性质比Sephadex更为稳定，可高压灭菌，在pH3~11条件下稳定，可用有机溶剂洗脱，也可用SDS、尿素及盐酸胍洗脱。Sepharose：琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状颗粒。琼脂糖由氢键维系，在pH4~9条件下稳定，超过40℃熔化，冷冻出现珠状。可分为Sepharose2B、4B、6B（即含琼脂2%、4%、6%）。SepharoseCL又称交联琼脂糖，是Sepharose同2，3-二溴丙醇在强碱下交联而成。在pH3~11条件下稳定。SepharoseFastFlow是经过高度交联的琼脂糖珠体，大大增加了其机械强度，以流速快为特征。由于流速快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性，可用多种有机溶剂清洗，还可用1-2mol/L的NaOH进行“原位清洗”。一些注意事项1)为了提高分辨率，柱高应为柱直径的20～40倍；2)上样量应小于柱床体积的5%，最大不应超过柱床体积的10%，上样的蛋白质样品浓度以不超过4%为宜，浑浊样品需离心后上样。3)洗脱时，流速要恒定。缓冲液的pH值、离子强度等必须都有利于蛋白质稳定；中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可能产生的相互作用；4)Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加10份水；在摇床上或手动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需24h或几天，加热可促进溶胀，1～2h即可完成；③：离子交换层析离子交换层析类型强酸型：磺乙基、磺丙基阳离子交换树脂中酸型：磷酸基弱酸型：羧甲基强碱型：三乙基氨基乙基、阴离子交换树脂二乙基（2—羟丙基）—氨基乙基中强碱型：二乙基氨基乙基弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基蛋白质纯化常用的离子交换剂蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的物质不易被破坏。纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE-Sephacel是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。葡聚糖系离子交换介质：主要以Sephadex系的产品为主，它是在SephadexG25及G50两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的BioProcess凝胶所代替。琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的多种离子交换剂。其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复使用，是目前使用最多的离子交换介质。3.细分离3.7AminoAcidCompositionofProteins氨基酸组成的蛋白质朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律在特定波长下，溶液中物质的光吸收与其浓度C（以mmol-1为单位）和溶液中光径长l（以cm为单位）成正比。A=εCl紫外吸收:Trp,λ=280nm;Tyr,λ=275nm;Phe,λ=257nm;3.8测蛋白质的C末端§1.切割位点（四种酶的酶切位点）羧肽酶:(1)羧肽酶劈开所有除了P,R、K(可以不做第二AAPro);(2)羧肽酶B劈开只有R和K(可以不做第二AAPro);(3)羧肽酶C劈开C末端AA,只有第二个AA是专业;(4)羧肽酶Y劈开;【Carboxypeptidase：(1)CarboxypeptidaseAcleavesallexceptforP,R,K(ItcannotdoneifsecondAAisPro);(2)CarboxypeptidaseBcleavesonlyRandK(ItcannotdoneifsecondAAisPro);(3)CarboxypeptidaseCcleavestheCterminalAAthatonlysecondAAisPro;(4)CarboxypeptidaseYcleavesall;】§3.Cleaveeachchainintosmallerfragmentsbysite-specificproteasesorchemicals（1）胰蛋白酶（胰酶）Chymotrypsin：C-terminalofPhe,Trp,Tyr.糜蛋白酶：C末端PheTrpTyr（2）化学试剂CNBR：切割C端的甲硫氨酸第四章、蛋白质的空间结构4.1蛋白质的构象二面角4.7肌红蛋白的结构和功能4.8血红蛋白肌红蛋白和血红蛋白属于同源蛋白质。（序列、功能相似相同）肌红蛋白Mb血红蛋白Hb4.10Measurementofprotein（蛋白质含量的测定）1．凯氏定氮法（Kjeldahl）蛋白质含量＝6.25×蛋白N含量消化：蛋白质+H2SO4强热和CuSO4→（NH4）2SO4+SO2↑+CO2↑+H2O蒸馏：（NH4）2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O滴定：（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO32．双缩脲法（biuret）（相对灵敏度不高）540nm3．Follin—酚法（Lowry）Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比（660nm）。可测定蛋白质含量的范围：25～250μg/mL。干扰因素：溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时。4．染料结合法（Bradford）CoomassieBrilliantBlueG-250(考马斯亮蓝g-250)5．BCA法(bicinchoninincacid)6．紫外吸收法（最大光吸收280nm）核酸干扰较大。纯蛋白质：OD280/OD2601.75，纯核酸：OD280/OD2600.5。OD280=εcL，需已知ε；蛋白质浓度（mg/mL）=OD280×F；用OD280/OD260查表知F因子蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×OD280—0.74×OD260；第五章、酶一、酶通论不是所有的酶都是蛋白质，一些RNA分子（核酶）也是酶。酶：全酶（holoenzyme）：脱辅酶与辅因子结合后所形成的复合物称为全酶。即全酶=脱辅酶+辅因子酶的分类：1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.连接酶酶的命名：1.习惯命名法①根据酶作用的底物命名，如淀粉酶、蛋白酶，有时还加上来源以区分不停来源的同一类酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶②根据酶催化反应的性质及类型命名，如水解酶、转移酶、氧化酶等。有的酶结合上述两个原则命名，如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。2.国际系统命名法以酶所催化的整体反应为基础，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，应在他们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“：”将他们隔开。若底物之一是水时，可将水略去不写。酶作为生物催化剂的特点1.酶易失活2.酶具有很高的催化效率3.酶具有高度专一性4.酶活性收到调节和控制许多酶需要帮助催化的非蛋白辅助因子1.辅因子包括金属离子及有机化合物。2.一些辅助因子结合酶蛋白紧密(非共价或共价),他们因此被称为辅基（prostheticgroups）。3.只有脱辅酶和它的辅因子的同时存在才起作用(称为全酶)。4.辅酶在酶催化中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。（Coenzymesusuallyfunctionastransientcarriersofspecificfunctiongroups.）5.维生素通常作为辅酶的前体。热力学define反应速率和平衡酶影响反应速率，不影响平衡结合能导致特异性和催化反应Bindingenergycanbeusedtoovercomethesebarriers:1)Entropy,therelativemotionoftwomoleculesinsolution;(entropyreduction)2)Thesolvatedshellofhydrogen-bondedwaterthatsurroundsandhelpstostabilizemostbiomoleculesinaqueoussolution;(desolvation)3)Theelectronicorstructuraldistortionofsubstratesthatmustoccurinmanyreactions;(Electronredistribution)4)Theneedtoachieveproperalignmentofappropriatecatalyticfunctionalgroupsontheenzyme.(Inducedenzymeconformationchange)1)降低熵值，使分子间作用时更稳定。2)去溶剂化，使底物暴露在无水且相对稳定的环境。3)电子在酶的催化下结构更容易变形，易进行再分配。4)催化剂诱导酶产生形变，重排。二、酶动力学米氏方程及其推导和应用(推导P357)米氏方程：][][maxSKSVvm[S]：底物浓度Vmax：酶完全被底物饱和时的最大反应速率Km：米氏常数（132kkkKm）根据米氏方程式可以说明以下关系：1)当[S]Km时，反应速率与底物浓度称正比，v与[S]的关系符合一级动力学。这时由于底物浓度低，酶没有全部被底物所饱和，因此在底物浓度低的条件下是不能正确测得酶活力的。2)当[S]Km时，反应速率已达到最大速率，这时酶全部被底物所饱和，v与[S]无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活力。3)当[S]=Km时，反应速率为最大速率的一半。因此Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。Lineweaver