基因工程知识点

1基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA技术。供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12种限制性内切酶的单一识别位点：Tetr基因内有7个酶切位点：BamHⅠ，SalⅠ：Ampr基因内有3个酶切位点：PstⅠ。EcoRⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。如果在pBR322质粒的Tetr基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tetr基因编码序列的连续性，使tetr失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Ampr基因内位点插入外源DNA片断，则反之。PUC18作载体的克隆外源基因的原理：2在pBR322的基础上，在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。典型的pUC系列的质粒载体包括如下4个组成部分：a、pBR322的复制起始点。b、氨苄青霉素抗性基因但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。c、大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因。d、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。2．理想载体的必备条件（1）、较小的分子量和较高的拷贝数。（2）、应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一酶切位点。（3）、具两种以上的选择标记基因。（4）、重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。3．穿梭载体和a-互补A穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。BlacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做α互补。第三章核酸操作的基本技术1．碱解法提取质粒DNA的原理？提取DNA时常用试剂的作用原理碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。常用试剂的作用溶菌酶：溶解菌体细胞壁的β-1，4糖苷键，即具溶菌作用。葡萄糖：增加溶液粘度，防止DNA受机械切力作用而降解EDTA：金属离子螯合剂，抑制脱氧核糖核酸酶（Dnase)对DNA的降解作用SDS：阴离子表面活性剂，①可破坏细胞膜，使DNA释放出来，②结合蛋白质，使蛋白质沉淀下来③抑制脱氧核糖核酸酶（RNase)的活性。3酚、氯仿：蛋白质变性剂。使蛋白质失水变性，；离心后与水相（含DNA）分离。异戊醇：降低分子表面张力，可减少气泡的产生；有助于分相。无水乙醇：DNA的沉淀剂。夺取DNA周围的水分，使DNA失水而易于聚合。NaOH：核酸在pH=5~9的溶液中稳定，pH12或pH3时会引起氢键断裂。KAc：KAc-HAc，pH=4.8缓冲液，变性的质粒DNA在此溶液中发生复性。2．RNA分离的关键因素。（RNA酶是一种蛋白质，所以提取时利用氯仿抽提可以很好去除，得到高质量的RNA。）RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶（RNase）的污染，因此在RNA制备过程中，必须注意控制RNase酶的活性，并设法抑制其活性。造成RNase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫。玻璃器皿：烘箱中（180℃)烘烤8h以上。塑料器皿：0.1%DEPC（diethylpyrocarbonate，二乙基焦碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤。配置的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌。全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换。RNA电泳槽常用去污剂洗涤，0.1%DEPC处理。提取中出现RNA降解原因：操作过程中温度太高、操作时有RNA酶的污染或RNase抑制剂量不足等都有可能使RNA降解。解决方法：做好使用器皿的RNase去除工作；在整个操作过程中最好在低温(4℃)或是冰上进行；操作者自始至终戴手套。3．电泳法和紫外分光光度法都能检测DNA的浓度和纯度，哪种方法更好。A、紫外光度法原理：核酸中含有嘌呤和嘧啶环，在256~265nm处显示出特征吸收峰，在230nm处吸收最小。DNA或RNA分子在260nm处有特异吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。方法：首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品；用TE或ddH2O为空白对照，在260nm及280nm处调节紫外分光光度计读数为0；加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值；A260值为1时相当于50ug/mL的dsDNA，40ug/mL的ssDNA或RNA；通过计算公式计算浓度及纯度。双链DNA（dsDNA）浓度（μg/ml）=50×OD260×稀释倍数单链DNA或RNA（ssDNAssRNA）浓度（μg/ml）=40×OD260×稀释倍数DNA纯度可通过OD260/OD280来衡量：纯的DNA的OD260/OD280为1.8~2.0；OD260/OD280＞2.0为RNA污染，＜1.8为蛋白质污染；OD260/OD280＜0.9时适当稀释样品，可再进行一次抽提；OD260/OD280＞2时则RNA过高，要除去RNA。B、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA在生理条件下，核酸分子是多聚阴离子当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。原理：在琼脂糖凝胶中加入EB，当与DNA混合时EB可插入到DNA分子中形成荧光络合物。而EB在4紫外光照射下能发射荧光，荧光的强度与DNA的含量成正比。便可十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的存在、强度和谱带的位置。在适当的染色条件下，荧光的强度同DNA数量成正比，据此，人们可以估计DNA的浓度。不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作者们便能判断DNA的分子质量，其有无降解；同时，通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较，还可测定出随迁移的DNA片段的分子质量。4．为什么核酸保存在TE溶液（Tris-HCl和EDTA）中比较稳定在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-Hcl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。第四章限制性内切酶1．寄主的限制与修饰的作用R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象。限制酶来完成R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏。寄主的限制与修饰有两个方面的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。2．RE识别序列的特点主要类型Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源三聚体异源二聚体辅助因子ATP，Mg2+，SAMMg2+ATP，Mg2+，SAM识别序列TGAN8TGCT或AACN6GTGC旋转对称序列GAGCC或CAGCAG切割位点距离识别位点1Kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游24~26bp处3．同裂酶同尾酶完全消化不完全消化星号活性同裂酶（isoschizomers）：来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶。同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别序列也各不相同，但能产生出相同的粘性末端的RE。由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接，在基因克隆中很有用。完全酶切消化（completedisestion)：如果一种RE对某个DNA分子的所有识别位点均实现了完全的切割，称为完全酶切消化。5限制性内切酶的不完全消化（partialdigestion)：RE对DNA分子的消化不完全，即未能在所有分子的所有识别位点进行完全的切割，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物。星号活性：非最适条件（酶量大、甘油高、低离子强度，高pH等）常使酶发生不正确切割（切割特异性序列相似的序列）。4．影响酶切的因素（1）、DNA纯度：DNA制剂中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高盐浓度等，影响RE的活性。提高酶切效率方法：增加RE用量；扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释；延长酶切时间。（2）、DNA甲基化程度：甲基化作用会强烈影响酶活性；基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的；不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源的细胞类型有密切关系。（3）、酶切反映温度：（4