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Prescission蛋白酶制作及使用方法柱下酶切用酶的制作方法1LTB菌体用PBS重悬至35ml做高压裂解,最终40ml总量。上清用0.5ml流速,挂3-4ml柱子,PBS漂洗30ml。用含有10%甘油的洗脱液洗脱,每管收集体积为2ml,只取主峰,可以粗略定量,也可以取百分之一的量在Akta上用上样泵来做积分定量(参考下面的积分定量方法举例)。也可以用分光光度计定量,一般可用稀释20倍定量。马上分装成0.25mg每管,可切5ml介质。柱上酶切用酶的制作方法亲和纯化方法同柱下酶切,洗脱液不含甘油,得到10ml左右洗脱液,浓缩10倍,再加入10ml含有10%甘油和2mMDTT的PBS稀释,一共浓缩三次换buffer,每次浓缩时间一般在30分钟以内。最终浓缩至10mg/ml,浓缩10分钟混匀一次。尽快分装成0.25mg每管,可切5ml介质。柱上酶切用酶的Q纯化制作方法亲和纯化方法同柱下酶切,洗脱液不含甘油,收集后加水大于三分之一。过Q柱,AB液配方中含有10%甘油,8%B洗脱,50%B?直接洗下后积分定量,分装。粗略定量参考2000峰宽为10.5ml,蛋白质总量为24mg,取了12ml,浓度为2mg/ml,直接分装的话,可以用125ul和250ul每份。积分定量方法举例取10ulppase浓缩液,用本底缓冲液(PBS)稀释到500ul,用上样泵做积分定量,积分体积为325mAu*ml,可知浓缩好的蛋白质光吸收为每毫升为32.5Au,光吸收为1,浓缩好的蛋白质浓度为32.5mg/ml,一共24mg蛋白。表达1.取-80度保存的质粒pGEX-PPase转化BL21(DE3)感受态,涂布,37度孵箱培养12~16h。2.挑取单克隆到50mlLBA培养基37度培养12-15小时。3.1%接种到1LTBA中,培养3小时,4度水浴降温,加终浓度为0.2mM的IPTG,15.3度诱导培养18小时。4.4000rpm离心20分钟收菌。加入PBSE(1mMEDTA)至终体积30-40ml重悬。纯化1.高压裂解2-3次。2.1.5万转离心30分钟,留上清。3.PBSS平衡5ml的GST柱,上样,PBSS漂洗,4℃放置过夜,等RNA降解,再用含有10%甘油和0.1%Tween20的酶切buffer漂洗干净。洗脱用含10%甘油的还原性谷胱甘肽溶液,2ml每管收集,取峰尖3*1.5ml。4.上样泵灌盐酸胍再生柱子,重力流灌水,灌20%乙醇,4℃保存柱子。酶切效率确定5ul,10ul,20ul酶切PH35C蛋白3-4天,电泳检测酶切产物,全部切开了。估计10ul过夜酶切1L的培养产物足够,下次实验再做验证。保存用PCR管,分装50ul每管,冻存于-80度。使用谷胱甘肽洗脱的融合蛋白,加入1份PPase,混匀后4度过夜酶切。缓冲液1.10*PBSS(欧蒙基础)配方:5包PBS粉剂(欧蒙),加入360ml5MNaCl,定容到500ml,4℃保存。2.500ml2MTris(pH8.0),500ml2MTris(pH7.4)350ml水溶解121.1gTris碱,加转子搅拌或振荡下溶解(需要10分钟左右),加浓盐酸调pH至所需值,抽滤后4℃保存。如温度升高,可加入预冷的水降温,温度下降1度pH升高0.03。pH6.8约需盐酸160ml,pH7.4约需盐酸70ml,7.6约需60ml,8.0约需42ml,8.0约需40ml。Tris缓冲液稀释10倍pH下降0.1,故如稀释为20mM使用,则pH下降0.2。3.1L2MTris不调pH800ml水溶解242.2gTris碱,加转子搅拌,定容至1L,抽滤后4℃保存。4.500ml0.5mMEDTA将93.05g二水乙二胺四乙酸二钠加入400ml水中,加入氢氧化钠颗粒调节pH(约需10g氢氧化钠颗粒),先加入7g左右,用搅拌棒彻底搅匀,在转子搅拌下,使其大部分溶解,静置一会儿,使气泡排出,并观察沉淀量。再继续搅拌,少量加入氢氧化钠颗粒,观察pH变化,勿使其变化过快,完全溶解后,加入4℃预冷的水(此时pH升高),继续调节pH为8.0,最终定容至1L,抽滤除去杂质,避光保存于4℃。5.10%Tween202mlTween20,溶于20ml水,避光保存,千分之一稀释使用(根据GE资料)。6.250ml20*酶切buffer储存液400mMTris-HCl(pH7.0-pH8.5),3MNaCl,20mMEDTA配方:2MTris-HCL50ml5MNaCL150ml0.5MEDTA10ml工作液成分(2MTris稀释100倍使用,pH值会下降0.2):20mMTris-HCl,150mMNaCl,1mMEDTA作为漂洗液,使用前添加0.1%TritonX100(或者Tween20),做为酶切液使用前添加0.01%Triton(或者Tween20)和1mMDTT。7.100ml20×还原性谷胱甘肽储液成分:200mM还原型谷胱甘肽,50mMNaCl,1mMEDTA,0.01%TritonX-100(用欧蒙Tween20替代),100mMTris(pH8.0)50ml离心管1支,称取6.14g还原型谷胱甘肽,加20ml5MNaCl,4ml0.5MEDTA,0.2ml10%Tween20再加水溶解至50ml,倒入100ml烧杯,再量取50ml2MTris(pH8.0),倒入100ml烧杯,搅拌溶解,滤器过滤至50ml离心管,1ml分装冻存于-20度。8.500ml7M盐酸胍称取334.4g盐酸胍,加水到450ml。定容,抽滤,室温保存。PPase信息1.PPase是人类鼻病毒蛋白酶HumanrhinovirusB从11号氨基酸(GPNTEFALSLLR),N端接入为BamH,尾端为EcoR。所用载体为pGEX4t2.pGEX4t-HR14载体表达蛋白质序列MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSGGGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ3.蛋白质参数Numberofaminoacids:410Molecularweight:46403.5TheoreticalpI:6.80Ext.coefficient49195Abs0.1%(=1g/l)1.060,assumingallpairsofCysresiduesformcystinesExt.coefficient48820Abs0.1%(=1g/l)1.052,assumingallCysresiduesarereduced1LLB,OD0.8左右诱导,收菌。缓冲液配制:1M6.8的Tris稀释50倍(稀释10倍下降0.1),上纯化仪,温度为9.7度,pH为6.8,25度测pH值应该是6.351M7.4的Tris稀释50倍,上纯化仪,温度为9.7度,pH为7.5,25度测pH值应该是7.05,所以酶切buffer可以用这个缓冲液稀释而成。二者混合后,pH为7.25,温度升高1度,下降0.03,所以如果25度测的话,应该下降0.45,pH值为6.8裂解Buffer:40mLof50mMTris-HCl,1mMEDTA,5mMDTTatpH8.8.纯化方法:4度30分钟之内,缓缓滴入1ml10%PEI,2万转离心,上清上GST柱,用谷胱甘肽洗脱,用PPaseBuffer(添加10%甘油)透析,浓缩到10mg/ml,然后分装,10ul相当于0.1mg的酶可以切2ml介质。如果浓缩到1mg/ml,100ul分装即可。500ml酶切buffer配方1.21gTris-HCl,15ml5MNaCl,1ml500mMEDTA,调节pH7.0,500ul1MDTT使用时添加20*酶切buffer配方:400mMTris-HCl(pH7.0),3MNaCl,20mMEDTA,20mMdithiothreitol(DTT可以使用时添加)100ml配方(调pH到7.0)2MTris-HCL20ml5MNaCL60ml0.5MEDTA4ml1L储存液配方(调pH到7.0)2MTris-HCL200ml5MNaCL600ml0.5MEDTA40ml10*酶切buffer配方(用1MTispH7.4):100ml配方(不需要调pH)1MTris-HCL20ml5MNaCL30ml0.5MEDTA2ml500储存液配方(不需要调pH)1MTris-HCL100ml5MNaCL150ml0.5MEDTA10mlSource:ComesfromHumanRhinovirus–HRV3CProtease.Thisisacysteineprotease.OurversionofthisproteaseisanN-terminalHis-GST-dual-taggedversionthatruns~47KDaonSDS-PAGE.CanberemovedbyeitherGST-orNi-affinityresins(WARNING:NeedtoremoveDTTpriortoNi-resinuse).Recognitionsite:LEVLFQ/GPisthestandardsiteinmostpGexvectors.Alternativesitescanbecleaved.LE-P4-LFQ/GP/=cleavedsiteP4=ValAlaorThr.StandardBuffer:20mMTRISpH=7.0150mMNaCl1mMDTTor5-10mMBME(TCEPTnottested)0.5mMEDTA(optional)Buffer:pHrangesfrom7.0to8.5seemoptimalTemperature:4Cisoptimalbutthisenzymewillworkatroomtemperature(4-15C).Salt:30-500mMNaClhavebeentestedwithnochangesinproteolysis.Reducingagent:Required.Need1mMDTTor5-10mMBME(TCEPhasnotbeentested).Nottoexceed2mMDTT.EDTA:(0to10mM)Oftenrequiredtominimizemetalpoisoningofthisenzyme(ieNi+2offNi-columnmayformadductsinpresenceofDTT).Firstdialyzeagainstcleavagebuffer+0.5mMEDTApriortoadditionofprotease.Detergents(TritonX-100,Tween-20,NP-40,Nonidet)0-1%(v/v).Cleavageinsolution1.FollowingelutionoftheGSTfusionproteinfromGlutathioneSepharose,dialyzetheeluateextensivelyagainstCleavageBufferinordertoremovereducedglutathionefromthesample.-Note:Alternatively,sampl
本文标题:Prescission蛋白酶制作及使用方法
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