5RNA的合成

1第十三章RNA的生物合成以DNA为模板合成RNA的过程叫作转录(transcription)。转录是遗传信息表达或基因表达的第一阶段。转录和DNA复制之间存在明显的区别。例如，DNA复制以DNA的两条链同时作为模板，可以将整个染色体复制成两个子染色体。而转录是有选择性的，染色体上只有特殊的某些基因或几组基因在某一时刻转录，而且往往利用1条DNA链作为模板。除了某些RNA病毒以外，所有的RNA都是转录产生的。转录除了产生三种主要的RNA:携带蛋白质合成信息的信使RNA(mRNA)、特异的氨基酸运输工具转运RNA(tRNA)和形成蛋白质合成场所的核糖体RNA(rRNA)。还包括一些其他的RNA分子，它们往往具有结构功能或催化功能。所有这些RNA都是由RNA聚合酶以DNA序列为模板拷贝合成。真核生物中主要有三种类型RNA聚合酶，分别负责合成不同的RNA，这三种RNA聚合酶是在进化中由存在于细菌中的单一的RNA聚合酶衍生而来的。在DNA双链中，起转录模板作用的链叫作模板链(templatestrand)或负链。而另l条非转录模板链通常称为编码链(codingstrand)或正链，其序列和转录产物相同(仅T替代U)。RNA聚合酶结合于DNA特异的转录起始区——启动子(promoter)。启动子通常靠近转录起点(startpoint)，即DNA中转录合成RNA的第一个碱基对，这个位点的核苷酸残基编号为+1。某些启动子的转录起点不是固定的，而是选择性出现于相邻的两个或三个碱基对中。RNA聚合酶合成RNA的方向为5´→3´，从转录起点沿RNA聚合酶运动的方向称为下游(downstream)，核苷酸残基编号依次为+2，+3……，而反方向为上游(up—stream)，核苷酸残基编号为-1，-2……。为方便起见，通常将DNA序列从左(上游)向右(下游)书写，并且仅用编码链序列代表基因，因为它和RNA序列相同。RNA聚合酶沿模板链运动合成RNA，遇终止信号停止。从启动子到终止序列(terminatorsequence)之间的DNA序列叫作转录单位(transcriptionunit)。1个转录单位可以表达产生1个RNA分子，它可能仅仅含有1个基因(主要是真核生物基因)，也可能含有多个基因(主要是原核基因)。初级转录产物(primarytranscript)是整个转录单位的RNA拷贝，它通常不稳定。在原核细胞中，初级转录产物可能很快降解(如mRNA)，或切割加工产生成熟的RNA分子(如rRNA和tRNA)。在真核细胞中，mRNA初级转录产物末端被修饰，并经过切割加工才能产生成熟RNA分子。rRNA和tRNA分子也要经过前体加工。第一节原核基因的转录起始60年代初，Jacob和Monod发现了细菌基因表达的主要形式操纵子(operon)，即1个启动子控制连在一起的多个结构基因的转录，并提出了E.coli的乳糖操纵子模型。不久，Ippen(1968年)和Pastan等(1970年)对这个模型作了若干重要补充。一、RNA聚合酶和启动子如同研究DNA复制始于E.coli的DNA聚合酶，人们探索转录机制先从E.coli的RNA聚合酶入手。细菌细胞中只有1种RNA聚合酶，它兼有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。RNA聚合酶是E.coli细胞中较大的蛋白之一，每个细胞中大约有3000个RNA聚合酶分子，其中一半在迅速生长的细胞中处于转录活性状态，而另一半和DNA松散结合并沿DNA随机运动，直到发现启动子。E.coli细胞中的RNA聚合酶有几种形式，其主要形式由5个亚基组成，两个较大的亚基是β´µ(156Kd)和β(151Kd)，两个较小的α亚基(37Kd)，以及1个σ亚基(70Kd，只σ70).2σ亚基是细菌基因的转录起始因子，它识别并结合于启动子，一旦转录开始就离开RNA聚合酶，代之以延伸因子结合于RNA聚合酶的核心酶(coreenzyme)。E.coli的RNA聚合酶全酶中最常见的σ因子是σ70，它识别绝大多数基因的启动子的共有序列，并且使RNA聚合酶对启动子的亲和力比非启动子序列的亲和力高104倍。其他σ因子(σ28、σ32、σ38、σ54)分别识别特殊基因的启动子(见第15章)。α亚基二聚体的结合位点处于启动子靠近上游的调节序列，它和转录频率(即启动子的强弱)直接相关。β´亚基主要结合于DNA的转录模板链，而β亚基则结合合成RNA所需的底物NTP，并催化形成磷酸二酯键。RNA聚合酶是1种多功能酶，它的功能包括：①寻找转录起点，即E.coli墓因组中的大约2000个启动子。②解开一小段DNA双螺旋，以便产生单链DNA转录模板。③选择正确的底物NTP，并催化合成磷酸二酯键，RNA链的合成方向为5´→3´，所以RNA聚合酶可以沿DNA模板链单向运动，直到转录完成。④识别转录终止信号。⑤和转录激活蛋白或阻遏蛋白相互作用，以调节转录速度，这是基因表达调控的主要步骤。和DNA聚合酶的活性相比，RNA聚合酶没有核酸外切酶活性，也就不具备校正和修复功能。所以，RNA能够从头合成，不需要引物，转录的忠实性自然比复制低得多，其误差率为10-4一10-5，比DNA复制的误差要高105倍。启动子是一段DNA序列，它是RNA聚合酶结合并起始转录的位点。1979年，Rosenberg等比较了46个E.coli操纵子的启动子序列，证明以-35和-10为中心存在共有序列(见第15章)。σ70因子结合于绝大多数E.coli启动子的-35区和-10区：(一)用紫外线照射RNA聚合酶—启动子复合物，发现这两个区的碱基和σ70的氨基酸残基原子之间形成共价交联。(二)在-35区和-10区发生的碱基突变可以造成基因转录明显减少。有的E.coli突变株可以校正上述突变，因为它的σ70基因发生了第二位点突变(second-sitemutation)，所改变的氨基酸残基和-35区(或-l0区)突变的碱基直接接触，从而消除了启动子突变产生的不利影响。(三)人们意外地发现，纯化的σ70亚基并不结合于启动子。为了解释这一矛盾现象，利用重组DNA技术获得了缺失N端一半的σ70变异体，发现它能特异结合于启动子。所以，可能只有野生型σ70亚基的N端部分结合于RNA聚合酶的其他亚基，才不会阻止σ70和启动子之间的相互作用。在σ70亚基多肽链中，从N端到C端有4个保守区(图13—2)，这些区在其他σ亚基中也存在。其中，2区与4区的氨基酸残基分别和启动子-10区和-35区的核苷酸残基相接触，2区的另一部分氨基酸残基为DNA解链所必需；而N端的1区则阻止2区和4区在没有RNA聚合酶的核心酶存在时结合于DNA；位于1区和2区之间的氨基酸残基和核心酶相互作用。σ70因子识别的启动子有强弱之分，即不同的启动子转录合成RNA的频率有高有低。E.coli的乳糖操纵子比较弱，而编码rRNA的6个rrn操纵子就属于强者(图13—3a)。启动子的强弱很大程度上取决于启动子的序列和RNA聚合酶之间的亲和力。绝大多数强启动子序列和-35及-10区共有序列非常一致，而弱启动子有几个位点和共有序列不同。例如，乳糖操纵子启动子的-10区为TATGTT，和共有序列(TATAAT)相比有两个碱基不同，如果这两个碱基突变，使之和共有序列相同，那么乳糖操纵子的表达将增加。乳糖操纵子启动子-35区也有两个碱基和共有序列不同。启动子共有序列发生突变经常使操纵子的转录频率明显下降。在σ70启动子中，-35区中的ACA和10区AA的出现频率都在75％以上，-35区的TTG和-10区的TA及最后13个T的出现频率为50％一75％，而-35区最后1个T和-10区第3个T的出现频率为40％～50％。E.coli基因组有6个拷贝rRNA操纵子，其启动子的转录能力在大约2000个E.coli启动子中是最强的。在这些具有极高转录速度的启动子中，位于-40至-60的富含A／T的序列必不可少。最近的研究结果显示，RNA聚合酶中的α亚基可以从核心酶中分离出来，以二聚体的形式结合于这一区域。如果α亚基发生突变，使它不能结合于-40至-60区，那么这些强启动子的转录速度就要下降，但这种RNA聚合酶对其他启动子的转录正常。上述结果清楚地表明，α亚基可以和启动子-40～-60区相互作用，并使启动子具有很高的转录活性。换言之，强启动子除了必须具备-10和-35区共有序列以外，RNA聚合酶的α亚基和-40～-60区的启动子调节序列相互作用也十分重要。在E.coli中发现的5种σ因子，除σ70以外的其他4种σ因子用于少数特殊基因的转录。在这4种σ因子中，σ28、σ32和σ38的氨基酸顺序都和σ70相似，它们也识别-10和-35区启动子，但其共有序列和σ70识别的启动子差别较大。而σ54的氨基酸顺序和其他σ70亚基的相似程度很低，而且它识别的启动子位于-12和-24区。RNA聚合酶催化的RNA合成主要分为3个阶段：起始、延伸和终止。二、转录的起始从E.coli乳糖操纵子的转录起始过程中，可以归纳出细菌基因转录起始阶段的一般规律(图13—4)：(一)转录始于DNA模板的一定区域。首先，RNA聚合酶和DNA形成封闭式复合物(closecomplex)，σ70因子紧紧结合于启动子序列，DNA双链仍保持碱基配对。(二)RNA聚合酶一旦结合于启动子，就催化双链DNA解旋，并打开约17bp的区域(约合B型DNAl.6圈)，形成开放式复合物(opencomplex)。这样，在DNA转录区产生了局部单链的转录“泡”(bubble)，暴露出复制模板链，使NTP(底物)能够与其相应的碱基(模板)配对。(三)接着，RNA聚合酶沿转录模板链运动(DNA3´→5´)，转录泡随之移动，同时以NTP为底物按5´→3´方向合成RNA链，使之互补于模板DNA链。新合成的RNA链的5´端核苷酸是高度特异的，为pppG或pppA。转录不需要引物，RNA可以从头合成。(四)当大约10个核苷酸已经聚合以后，RNA聚合酶释放σ因子，代之以延伸因子结合于核心酶并继续转录。(五)操纵子的转录调节主要通过阻遏蛋白和激活蛋白。阻遏蛋白结合于操纵基因(operator)，这一序列一般位于+30～-50，它和启动子部分重叠，从而抑制了RNA聚合酶的转录起始。而激活蛋白通常结合于启动子的上游序列(-30～-65)，或转录起点的下游，它和RNA聚合酶接触并促进转录起始。(六)细菌经常利用不同的可互换的σ亚基，以识别特殊的启动子，并调节基因的开关。尽管以上这些规律适用于绝大多数E.coli的启动子，但是对100多个不同的启动子的研究结果显示，每个启动子的转录调节都各有其特点。第二节真核基因的转录起始在迄今所研究的所有真核细胞核中都含有三种RNA聚合酶。RNA聚合酶I主要合成rRNA，RNA聚合酶Ⅱ主要合成mRNA，而RNA聚合酶Ⅲ的转录产物主要是tRNA和5SrRNA.一、真核基因转录起始的一般规律在原核基因转录起始过程中，RNA聚合酶承担了识别启动子的作用，某些启动子可能还需要辅助因子参与识别。在真核基因转录起始阶段，辅助因子的重要性大大提高了。识别真核基因的启动子序列，起主要作用的通常是蛋白因子---转录因子，而不是RNA聚合酶本身。转录因子的定义是，转录起始所需要的非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白。真核启动子由一组特征性的保守短序列组成，供特异的蛋白因子或RNA聚合酶识别。4某些序列元件存在于不同的启动子中，并且有共同的蛋白因子识别它们；而有的元件则通过不同组合出现于一个个启动子之中，用于特殊的基因表达。绝大多数RNA聚合酶I和Ⅱ的启动子位于转录起点的上游，而某些RNA聚合酶Ⅲ的启动子位于转录起点下游。RNA聚合酶Ⅱ使用的启动子在序列上变化很大，它们由若干标准大小的元件(elements)组成。这些顺式作用短序列元件位于转录起点上游，通常分布在大于lOObp的区域内，元件之间的序列并不重要(可能有分隔作用)。真核和原核mRNA转录起始的一个明显区别是，真核启动子转录涉及大量结合于不同顺式作用元件的因子，所以启动子的定义区域包括这些