第七章食品中常见微生物检验技术(1)

1第七章第七章食品中常见微生物检验技术食品中常见微生物检验技术成都大学生物产业学院食品微生物检验技术2主要内容主要内容食品中菌落总数的测定大肠菌群计数法金黄色葡萄球菌的检测食品中酵母菌和霉菌计数法食品中乳酸菌的检验食品中常见微生物检验技术第七章3食品中微生物检验指标食品中微生物检验指标菌落总数（细菌数量）大肠菌群数（MPN）；致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等）食品中微生物检验常用的三项指标：食品中常见微生物检验技术第七章4一、菌落总数的测定一、菌落总数的测定菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：细菌总数和菌落总数。1.菌落总数的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章5一、菌落总数的测定一、菌落总数的测定细菌总数：指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数，其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数，通常以1g或1mL或lcm2—样品中的细菌总数来表示。1.菌落总数的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章6一、菌落总数的测定一、菌落总数的测定菌落总数：是指食品检验样品经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每1g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。由于现有条件不能满足厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温细菌等的生理需求，故难以繁殖生长。1.菌落总数的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章7一、菌落总数的测定一、菌落总数的测定因此，菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。1.菌落总数的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章82.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2-3个适宜稀释梯度的样品匀液各取1mL分别加入无菌培养皿内每皿中加入15-20mL平板计数培养基，混匀培养计数各平板菌落数计算菌落总数报告菌落总数检验流程9菌落总数的测定102.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定平板计数琼脂培养基（plate-countagar,PCA）7.0±0.2pH1.0g葡萄糖1000mL蒸馏水2.5g酵母浸膏15.0g琼脂5.0g胰蛋白胨制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装试管或三角瓶，灭菌备用。无菌生理盐水1000mL蒸馏水8.5g氯化钠制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，灭菌待用。112.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定磷酸盐缓冲液制法贮存液：称取34.0g磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水定容至1000mL后贮于冰箱；稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，高压灭菌备用。7.2pH500mL蒸馏水34.0g磷酸二氢钾122.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定(1)以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。注：固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1-2min，制成1:10的均匀稀释液。2.1样品的处理和稀释132.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定(2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。(3)另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2.1样品的处理和稀释142.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定(1)根据标准要求或对样品污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，在进行10倍梯度递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内做空白对照。2.2倾注培养152.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定(2)及时将15-20mL温度冷却至46℃的平板计数琼脂培养基注入平皿，并转动平皿使其混合均匀。(3)待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2.2倾注培养162.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀，如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20mL不等，一般以15mL较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。注意事项-培养基的温度和培养基的量172.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定为了使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转；检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。注意事项-操作时间182.菌落总数的测定方法（GB4789.2-2010）菌落总数的测定一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。注意事项-培养温度192.3菌落计数菌落总数的测定方法培养到规定时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。到达规定培养时间后，如果不能立即计数，则应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。20菌落总数的测定方法2.3菌落计数①选取菌落数在30-300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数；②30cfu的平板记录具体菌落数，300cfu的可记录为多不可计；③每个稀释度的菌落数应采用2个平板的平均数。21菌落总数的测定方法2.3菌落计数④其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；⑤若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数；⑥当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落技术。22菌落总数的测定方法2.4结果与报告①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为1g（mL）样品中菌落总数结果；②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300cfu之间，则视二者之比值来确定，若比值2，应报告其平均数；若比值2则报告其中较小的数字；③若所有稀释度的平均菌落数均300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；菌落总数的计算方法23菌落总数的测定方法2.4结果与报告④若所有稀释度的平均菌落数均30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；⑤若所有稀释度均无菌落生长，则应以1乘以最低稀释倍数计算；⑥若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。菌落总数的计算方法24菌落总数的测定方法2.4结果与报告菌落总数的计算方法10-110_210_31多不可计16420/1640016000或1.6x1042多不可计295461.63775038000或3.8x1043多不可计271602.22710027000或2.7x1044多不可计多不可计313/313000310000或3.1x105527115/270270或2.7x1026000/1x10107多不可计30512/3050031000或3.1x104报告方式(个/g或个/ml)例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数(个/g或个/ml)稀释度选择及菌落数报告方式表例25菌落总数的测定方法2.4结果与报告①菌落数100cfu时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；②菌落数100cfu时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，取2位有效数字；③若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延；④若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。菌落总数的报告26菌落总数的测定方法2.4结果与报告复核：日期：日期：检验员：空白10-410-310-210-11平均数BA结果报告数（cfu/g或ml）平板计数琼脂培养基培养基接种菌落总数测定依据GB4789.2-2010检验依据菌落总数检验日期抽样日期生产日期班次生产车间产品名称食品微生物检验-菌落总数测定报告27菌落总数的测定方法2.5菌落总数的其它检验方法涂布平板法将营养琼脂制成平板、经50℃1-2小时或35℃18~20小时干燥后，在上面滴加检样稀释液0.2mL，用“L”棒涂布于整个平板的表面；放置约10分钟，将平板翻转，放至36+1℃温箱内培养24±2小时，（水产品用30℃培养48±2小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由0.2mL换算为1mL)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每g或每L检样所含菌落数。这种方法比常规检验法效果好。因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆．但是本法取样量比常规检验法少，代表性会受到一定影响。28菌落总数的测定方法2.5菌落总数的其它检验方法点滴平板法与涂布平板法相似，不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(每滴相当于0.025mL)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在平板背面用标记笔划成四个区域)；每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法+检样移入温箱中，培养6-8小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0.025mL换算为1mL)，再乘以样品的稀释倍数，即得每g或每mL检样所含菌落数。29二、大肠菌群计数法二、大肠菌群计数法大肠菌群：指一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。1.大肠菌群的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章30二、大肠菌群计数法二、大肠菌群计数法大肠菌群主要来源于人畜粪便，股以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否与粪便接触及被粪便污染的程度，同时也间接地反映食品受肠道致病菌污染的可能性。1.大肠菌群的概念及卫生意义食品中常见微生物检验技术第七章31二、大肠菌群计数法二、大肠菌群计数法大肠菌群MPN计数法：基于统计学原理和方法计算出的一种最近似数值，食品中的大肠菌群数是指每克（mL）检样内大肠菌群最可能数（MPN）。大肠菌群平板计数法：取适宜的稀释度的样品接种到VRBA平板上培养后计数典型和可疑菌落，再转接到BGLB肉汤管培养进行确认试