动物细胞工程(上课)

动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术其它动物细胞工程的基础一、动物细胞培养1、概念：2、原理：细胞增殖笔记3、过程：4、条件5、应用概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.2、原理：细胞增殖1、动物细胞培养的概念动物机体组织单个细胞原代培养胰蛋白酶胶原蛋白酶分装传代培养加培养液细胞悬液胰蛋白酶或3、过程•原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。•传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制4.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒的环境：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物细胞的全能性细胞株、细胞系植物体或组织培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理：动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程---示动物克隆---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕受体黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示：b表示:2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。3、多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据。4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。4.体细胞核移植技术的应用前景1.在畜牧业上，利用体细胞克隆技术促进优良畜群繁殖。2.保护濒危物种。4.体细胞核移植技术的应用前景3.5.体细胞核移植技术存在的问题看书P49-50页1、定义：指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合◆细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。◆杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用动物细胞融合2、诱导融合的因素•生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)•化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.•物理法：电激融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞3、动物细胞融合技术的应用•细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。•利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。•人们获得抗体的传统方法是?–将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体•这种方法的缺点是什么?–效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。•运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？•能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用——单克隆抗体的制备思考单克隆抗体的制备—极富创造性的方案将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。•米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。杂交细胞灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞经免疫的小鼠提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体3）、为何要进行两次筛选？4）、如何进行第2次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：1）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体•1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.•2、用于治疗疾病和运载药物：•主要用于癌症治疗。•生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）2、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。3、单克隆抗体的应用[例题2]（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选)（）A．T淋巴细胞B．效应B淋巴细胞C．抗体D．记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是(多选)（）A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克隆抗体C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不能无限增殖D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显BCDACD已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。方法：。原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖1.动物细胞工程技术的基础是：（）A．动物细胞融合B．胚胎移植C．动物细胞培养D．核移植Ｃ课堂练习;２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A．结果是相同的B．杂种细胞的形成过程基本相同C．操作过程中酶的作用相同D．诱导融合的手段相同Ｂ３.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。方法：。原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖