细胞培养1

细胞培养细胞结构、成分和培养技术一、细胞的基本结构（一）概念：细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。一般认为：1细胞是由膜包围的原生质（Protoplasm）团，通过质膜与周围环境进行物质和信息交流。2细胞是构成有机体的基本单位，具有自我复制的功能，是有机体生长发育的基础。3细胞是代谢与功能的基本单位，具有一套完整的代谢和调节体系。4细胞是遗传的基本单位，具有发育的全能性。（二）细胞结构---总览细胞是现代生物体最基本的结构单位。DNA中储存着细胞结构和作用信息，细胞有一套完善的机制来建构自身、发挥功能，从而维持自身活性，其中包括产生两个子细胞的细胞分裂（有丝分裂）作用；是包裹着核仁的双层膜结构，上面有很多复杂封闭结构的气孔。核膜也与内质网相连。内质网是膜物质，是蛋白质合成场所。粗糙内质网上覆盖着核糖体，粗糙内质网中生成的蛋白质被运输到平滑内质网,平滑内质网上无核糖体。内质网是膜物质。内质网中生成的蛋白质被运输到平滑内质网,平滑内质网上没有核糖体。中心体是微管的起源，微管构成细胞骨架为细胞制造能量，线粒体中含有酶，参与制造高能量分子，（如，ATP，三磷酸腺苷）ATP是细胞中常见的能源物质，例如，ATP提供能源物质给马达蛋白主要是一层脂质双分子膜，包围细胞，使之与外界隔绝。同时，细胞膜也包含很多通道，物质交换在这里发生。细胞膜也包含连接结构，将相邻细胞紧密连接起来GolgibodytransformsandpacksproteinsandothersubstancesproducedintheER.核仁包含着用DNA（脱氧核糖核酸）记录的细胞结构功能信息。（三）动物、植物细胞的结构二、细胞的化学成分组成细胞的基本元素是：O、C、H、N、Si、K、Ca、P、Mg，其中O、C、H、N四种元素占90%以上。细胞的化学元素可分为两大类：无机物和有机物。在无机物中，水是最主要的成分，约占细胞物质总含量的75%--80%。二、细胞的化学成分1水与无机盐水是原生质最基础的物质。无机盐。2细胞的有机分子蛋白质核酸糖类脂类3酶与生物催化剂酶RNA催化剂三、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内取出组织摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其基本结构和功能的一种培养技术，细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。细胞体外培养的三个层次：组织培养（TissueCulture）细胞培养（CellCulture）器官培养（organCulture）以上三个层次的培养，又可统称为体外培养（InVitro）.体外培养包括：细胞培养、组织培养、器官培养。四、动物细胞培养方法1静止培养：应用细胞管、多孔板、罗氏瓶等；培养时静止不动。注意以下几点:①培养量一般不要超过总体记得1/3，液体厚度不要超过1cm.②若用普通温箱培养，必须盖紧盖子或塞紧橡皮塞。若用CO2培养箱培养，则不要盖紧瓶塞，并将CO2浓度控制在5%。③一般2d换一次液，细胞长成单层要及时分种传代。四、动物细胞培养方法2施转培养应用转瓶，并放置在转床上培养。为了增加培养细胞面积，可以在转瓶内加入多层同心圈。3悬浮培养它适应于一切能在悬浮条件下生长增殖的细胞，即贴附依赖性细胞。用于该类细胞培养的设备结构基本与培养细菌的相同，用于细胞培养的称为生物反应器。四、动物细胞培养方法4微载体培养它适于一切贴附依赖性细胞，即贴壁细胞的培养，用葡聚糖制成微粒，即微载体培养贴壁细胞的新技术。5微载体在低速搅拌时就可以悬浮。6微载体培养的传代和扩大培养。7微载体的再生利用。为了降低载体的消耗，有些类型的微载体还可以再生利用。四、动物细胞培养方法8巨载体和微囊培养将细胞包埋在凝胶体或微囊内，也叫包埋体。由于有的凝胶载体制备的较大，直径在2—3mm，因此又称为巨载体培养。9多孔微球培养它把微载体和巨载体两者优点结合在一起，细胞既可附着在载体表面，又可以渗入载体较大的孔隙而生长在在体内。四、动物细胞培养方法10中空纤维培养该培养器模拟机体的毛细血管系统，有数百至数千根中空纤维集束组成。该纤维的材料为聚砜丙烯聚物，纤维壁厚50—75um,成多孔性。内层有超滤膜，内腔用以灌流充以氧气的培养，外腔用以培养细胞。11灌流培养过滤培养法，它的特点是在培养过程中，不断的灌流补充新的培养基，同时不断地排出已消耗的培养基及细胞代谢过程中新生的有害物质，这样就可以大大的培养密度，提高细胞的产量。五、细胞培养的环境1无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件，当细胞放置在体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力。一但被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染，代谢物及时消除等是维持细胞生存的基本条件。2恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定的适宜温度。人体细胞培养的标准温度36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。五、细胞培养的环境3气体环境气体是细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需要的各种成分，如三大营养素：蛋白质、糖类、脂类。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数的细胞的适宜PH值是7.2—7.4。五、细胞培养的环境4细胞培养基培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖、增值的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类：（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。五、细胞培养的环境①无机盐CaCl2、、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4对调解细胞渗透压、某些酸的活性及溶质的酸碱度都是必要的。②氨基酸颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸，它们都是细胞用以合成蛋白质的必然原料。③维生素维生素是维持细胞的一种生物活性物质，在细胞中大多数形成酸的辅基或辅酶，对细胞的代谢有重大影响。④碳水化合物碳水化合物使细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分，几乎所有的培养基都以葡萄糖作为必含的能源物质。细胞培养的环境（2）天然培养基使用的最普遍的天然培养基是血清，如小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子，促贴附因子及其多活性物质，与合成培养基合用。5细胞培养设施和基本条件①实验室环境，如净化条件。②常用实施及设备。③培养器皿等。六、培养细胞形态体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能附在支持物上生长特征，可分为贴附性生长和悬浮性生长两大类。1成纤维型细胞在培养中的细胞及形态与成纤维细胞类似时，皆可称为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名。细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央与卵圆形核，胞质向外伸出2—3厘米。六、培养细胞形态2上皮细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长，具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有圆形核，细胞紧密相连，单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞，如皮肤，表皮衍生物，消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮形态生长。3游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则，如羊水细胞培养的早期。七、营养液配制1.HanK’S液10倍浓缩液：①甲液NaCl80g,KCl4g,CaCl21.4g,MgSO42g.②乙液Na2HPO41.52g,KH2PO40.6g,葡萄糖10g,1%酚红溶液16ml.③甲乙液按顺序分别溶于注射用水450ml中，然后将乙液加入甲液，补足水至1000ml，过滤后加入氯仿2ml，置2—8℃保存，使用时作10倍稀释。116℃15分钟，使用前7.5%NaHCO3调PH值7.2—7.4。七、营养液配制2营养液0.5%乳汉液，水解乳蛋白5g，HanK’S液1000ml，完全溶解后分装，经116℃15分钟，2—8℃保存备用。使用时为7.5%NaHCO3溶液，将PH值调到7.2—7.4。33%谷氨酰胺溶液L--谷氨酰胺3g，注射用水100ml，溶解后，滤过除菌，-20℃保存，使用时100ml细胞营养液加3%谷氨酰胺溶液1ml。七、营养液配制4细胞分散液：0.25%胰蛋白酶溶液NaCl8g,KCl0.2g,枸橼酸钠1.12g，磷酸二氢钠0.056g，碳酸氢钠1g，葡萄糖1g，胰蛋白酶（1：250）2.5g，注射用水加至1000ml。放2—8℃，待胰蛋白酶完全溶解后，用0.2um的微孔滤膜或G6型玻璃器滤过除菌。分装小瓶中，-20℃保存。57.5%NaHCO3溶液碳酸氢钠7.5g，注射用水100ml。用微孔或蔡氏滤器滤过除菌，分装小瓶，冻结保存。6双抗液八、清洁液配制1稀配方：重铬酸钾100g，加纯化水750ml，加温溶化，冷却后缓缓加入浓硫酸250ml。2浓配方：重铬酸钾79g，加纯化水100ml，加温溶化，冷却后缓缓加入浓硫酸1000ml。3注意：配制消毒液时，浓硫酸必须缓缓加入，若注入过快，易产生大量的热反应，危险。九、细胞制备工艺取10日龄SPF鸡胚无菌手术取出鸡胚用HanK’S液洗3遍去头到入小烧杯剪碎用HanK’S液洗3遍将剪碎的组织倒入0.25%胰酶液中37℃消化40分钟（或置入2—8℃冰箱过夜）倒掉胰酶液加玻璃珠分散细胞加入营养液分装到培养瓶内（1500ml/1万毫升瓶）上转瓶机（9—11转/小时），36--37℃培养24小时，形成致密的单层成纤维细胞提供接种病毒用。十、附录：细胞计数1先用培养基将细胞悬液作适当稀释。2吸取少量悬液，滴于计数板上盖涂片，一端让悬液自动进入盖片下间隙，勿留气泡。3镜下观察并计算出四角大格内的细胞数，计算的时候注意只计上线和右线的细胞，按下式计算细胞浓度。4细胞数/ml=4大格中细胞总数/4*10000*稀释倍数。谢谢！