6种检测方法

高效液相色谱六种定量方法原理及使用条件六种定量方法•1、峰面积百分比法•2、峰面积归一法•3、外标法•4、杂质检查法•5、内标法加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法峰面积百分比法•按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。某化合物百分含量（%）=简单的说就是配制溶液，进样，按峰面积百分比法读取含量。一般系统适应性主要考察分离度。（如：双乙酰阿昔洛韦。D-NAP方法，P4）峰面积Σ峰面积×100%优点：快速、简单、无需考察系统重复性（进样量不严格）无需对照品缺点：测定误差大，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。峰面积百分比法峰面积归一法在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液（一般为100%限度加样溶液），进样，记录色谱图，按式中：Ci—加样溶液中加入的杂质百分含量；Ai1—回收异丙醇中杂质的平均峰面积；Ai2—加样溶液中杂质的峰面积；Cs—加样溶液中主成份的百分含量；As—加样溶液中主成份的峰面积。计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常定位或以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。峰面积归一法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积，加入校正因子计算各组分面积及总峰面积。计算各组分折算后峰面积占总峰面积的百分比。公式如下：某化合物百分含量（%）=比面积百分比法多了一步校正因子计算。如双乙酰阿昔洛韦。若杂质含量较少，乘校正因子对总面积影响较小，可按结果×校正因子报告。若杂质含量较大或个数较多，乘校正因子对总面积影响较大，需按峰面积乘校正因子重新计算总峰面积后再计算。（如：vcv有关物质2等）峰面积×响应因子Σ峰面积×响应因子×100%优点：快速、简单、无需考察系统重复性（进样量不严格）验证时需对照品，之后无需对照品。缺点：同峰面积百分比法。误差较大，但比百分比法准确。峰面积归一化法外标法•建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：•含量（%）=（CR/CX）(AX/AR)*100•式中CR——对照溶液中待测组分浓度；CX——供试品溶液中待测组分浓度；AX——供试品溶液中待测组分浓度；AR——对照溶液待测组分峰面积。系统适应性中需考察重复性。基本原理：浓度和峰响应成线性。（如各产品项下含量方法，CPGBSA杂质A、基因毒性杂质等）外标法•优点：外标法方法相对内标法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量准确。对照品好找，用待测组分的纯品作为对照品。•不足：1、进样量必须准确。此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。2、仪器及人员精密度要求较高。需控制实验条件稳定性。3、定期校正。4、只能每个待测组分均需进其对照溶液。但此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。杂质检查法1、加校正因子的主成分自身对照法已知且有对照品杂质2、不加校正因子的主成分自身对照法未知或无对照品杂质已知杂质且有对照品的我们现在都加校正因子，未知杂质按1.0计。除另有规定外，校正因子大于等于1.0时，保留至小数点后1位，反之，保留至小数点后两位；结果为0.80~1.2之间，通常按1.0计，反之，杂质浓度计算时，应乘以测试得到的校正因子。加校正因子的主成分自身对照法•在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，或根据线性检测结果计算。f=或f=计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。A杂/C杂A样/C样K样K杂加校正因子的主成分自身对照法•需系统适应性考察：1、灵敏度考察：定量限最低要求在杂质一半限度以下。（可调节进样浓度或进样量）2、系统适应性考察：通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%3、供试品溶液的记录时间，除另有规定外，一般为主成分色谱峰保留时间的2倍。方法确定后不调节。加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，进样自身对照溶液（自身对照溶液：供试品溶液稀释至主成分浓度一般为杂质限度浓度）测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。公式为：杂质含量（%）=式中：AIM待测杂质峰面积；C对自身对照溶液中供试品浓度；A对待测杂质峰面积；C供试品供试品浓度；f校正因子。Aim*C对A对*C供试品*f*100不加校正因子的主成分自身对照法•测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。•基本除校正因子步骤外，其余同加校正因子自身对照法杂质检查法优点：相对较准确。首次验证时用相应对照品确定校正因子后，样品检测时只要用供试品作为对照品。只需定位溶液或RRT定位。节省杂质对照品有关物质检测溶液配制简单。缺点同外标法，需较高的仪器人员环境稳定性。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品的色谱图1，再记录等体积纯溶剂的色谱图2.色谱图1上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图2上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。即扣除空白溶剂法。杂质检查法•与外标法区别外标法：对照和待测组分为同一物质，只能校正进了对照溶液的组分。（主成分对应主成分对照，杂质对应杂质对照）自身对照法：对照一般为待测供试品。（所有待测组分均对应主成分对照）如：阿昔洛韦USP有关物质中鸟嘌呤为外标法。其他杂质为自身对照法。内标法1、原理•按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子f：f=•式中：As为内标物质的峰面积或峰高；Ar为对照品的峰面积或峰高；•Cs为内标物质的浓度；Cr为对照品的浓度。f即内标物质与待测样品响应比值。需考察仪器响应重复性。即校正因子重复性。As/CsAr/Cr内标法•再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量CX：Cx=f*=*•式中：Ax为供试品峰面积或峰高；Cx为供试品的浓度；A′s为内标物质的峰面积或峰高；C′s为内标物质的浓度；f为校正因子。AxA’s/C’sAs/CsAr/CrAxA’s/C’s内标法•1、优点：①、在进样量不超限(色谱柱不超载)的范围内，采用内标法（因为采用同一针比值来计算），定量结果与进样量的重复性无关。②、只要被测组分及内标物出峰，且分离度合乎要求，就可定量，与其他组分是否出峰无关。③、很适用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量。由于杂质(或微量组分)与主要成分含量相差悬殊，无法用归一化法测定含量，用内标法则很方便。加一个与杂质量相当的内标物。加大进样量突出杂质峰，测定杂质峰与内标峰面积之比，即可求出杂质含量。第1条主要针对外标法。2,3两条主要针对面积归一化法。因组分浓度太小时不能检出，组分浓度太高时不能呈线性。内标法•2、不足：因内标物选择需符合以下要求:（1）内标物是原样品中不含有的组分，否则会使峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积；（2）化学性质与样品相似（3）内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。（4）与样品有相似响应值（5）不会与样品发生反应（6）色谱性质稳定（7）内标物的保留时间应与待测组分相近，但彼此能完全分离(R≥1.5)（8）可得到分离良好的，干净利落的峰故样品配制比较麻烦和内标物不易找寻是其缺点。且现在仪器精密度较好，一般不存在仪器精密度问题，故常用外标法（含量）或杂质检查法（有关物质）控制。部分原料中间体会用面积归一化法控制。（一般考察线性、灵敏度浓度达到杂质指标限度一般以下）总结优点缺点应用范围百分比法无需校正进样量不严格要求检测器响应需一致所有组分峰都需流出且被检测到所有面积积分都需准确测定误差大主要用于原料中间体等对定量要求不高的产品归一化法进样量不严格要求所有组分峰都需流出且被检测到所有面积积分都需准确必须校正所有峰测定误差稍大外标法校正检测器响应只对待检组分做校正无需所有峰都流出或检测进样量必须准确仪器及人员环境都需很好稳定性定期校正有对照品产品含量,有关物质内标法进样量不严格只对需检测峰校正检测检测器响应溶液制备及计算复杂因现实验各环节均控制较好，且内标物选择较难，现基本不用杂质检查法加校正因子的主成分自身对照法对照品易得，相对较准确。首次验证时用相应对照品确定校正因子后，样品检测时只要用供试品就好。只需验证时确定校正因子，样品检测时只需定位或RRT判定保留时间，节省杂质对照品。同外标法首次验证时需对照品确定校正因子已知且有对照品有关物质不加校正因子的主成分自身对照法同外标法未知或无对照品有关物质检测