人类染色体标本的制备及G显带核型分析

人类染色体标本的制备及G显带核型分析安徽医科大学基础医学院生物学教研室[目的和要求]1.掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。2.熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带染色体的核型分析技术。[实验原理]染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析。染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨（Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断及研究中具有重要意义。人类体细胞的正常核型组染色体号主要特征A组B组C组D组E组F组G组123亚中着丝粒染色体中央着丝粒染色体4————5亚中着丝粒染色体、无随体6————12、X亚中着丝粒染色体大小13————15近端着丝粒染色体、有随体161718亚中着丝粒染色体中央着丝粒染色体19————20中央着丝粒染色体21————22、Y近端着丝粒染色体、有随体Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体基因组与核型基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基因组(genome)，它代表了一个生物体染色体中储存的全部遗传信息。显带染色体：pq3211234643215213121212354121324用特殊的染色方法使染色体沿其长轴显示出明暗交替或染色深浅不同的横纹——带。正常男性：46，XY正常女性：46，XX正常人体细胞染色体带型模式图[实验用品]1．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温培养箱、恒温水浴锅、10ml刻度离心管、低速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。2．材料：人外周静脉血。3．试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、0.075mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液。[实验步骤](一)人类外周血染色体标本的制备1．采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。2.超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，每瓶加0.3～0.5ml全血。轻轻混匀。3.37℃恒温培养箱静置培养72h左右（培养24h后水平轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。4.培养至68～72h（即终止培养前2～4h），每瓶加秋水仙素(20μg/ml)至终浓度0.1～0.2μg/ml，轻摇培养瓶混匀，继续培养2～4h。5.终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10ml玻璃离心管，配平，1800rpm离心6min。6.低渗弃上清。加入37℃预温的0.075mol/L氯化钾8ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20min。7.预固定加入1ml新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸=3:1），轻轻混匀，1800rpm离心6min。8.固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8ml，轻轻混匀，室温下静置固定20min。9.弃上清，重复固定1次。10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。12.37℃温箱放置3～4天或70℃烘烤2h进行老化处理，以备显带分析用。【实验方法和步骤】1、预处理：实验前3---4小时，取健康小鼠，每只腹腔注射0．01％秋水仙素0．3---0．4ml。注意不要伤及内脏。2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠的头部，另一只手拉住它的尾巴，用力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛，取出小鼠的股骨，剔除上面的肌肉，洗净。(二)人类染色体的G显带1.胰蛋白酶准备：在盛有45ml0.85%生理盐水的染缸中加3ml0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8～7.2，置37℃恒温水浴锅中预温。2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋白酶溶液中处理2～3min，不断轻摇载玻片以保证作用均匀充分。3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶的作用。4.染色：用吉姆萨工作液染色10～15min。5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电吹风吹干。6.镜检：光学显微镜下观察分析核型。(三)G显带的核型分析1.选取染色体分散良好、长度适中染色体G显带核型照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。2.配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照染色体的大小、形态、着丝粒的位置，随体的有无和G显带带型等特征将46条染色体配成23对。3.染色体排列：将配成23对的染色体按大小次序排列，一对性染色体排在最后，并把排列好的23对染色体分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成46,XX或46,XY。正常男性染色体G-显带核型人类染色体G-显带特征口诀：一秃二蛇三蝶飘四鞭炮五黑腰六号是个小白脸七上八下九苗条十号长臂近带好十一低来十二高十三四十五下、中、上十六q2缢痕大十七长臂带脚镣十八人小肚皮大十九一点腰二十头重又脚轻二十一象个葫芦瓢二十二头带小黑帽X一担挑，Y是黑脚[注意事项]1.染色体标本制备中的关键因素包括秋水仙素的用量和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗时间很重要，处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。2.G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、温度、pH等。其中胰蛋白酶溶液应37℃充分预热，溶液pH应维持在6.8～7.2，以保证酶活性的发挥。另外消化要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则带纹模糊甚至损失。[作业与思考题]1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理。2.总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意事项。3.制作人的G显带正常核型配对分析图。