微生物检验厌氧性细菌及检验

第二十二章厌氧性细菌及检验本章考点：1.概述概念，分类标准及分类2.厌氧菌的分布与临床意义自然界和正常人体中的分布，临床意义3.厌氧菌标本的采集与送检标本的采集方法，标本的运送和处理4.分离与鉴定检验程序，检验方法概述一、概述（一）概念厌氧性细菌是一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。（二）厌氧菌的分类主要厌氧菌的分类见表5-22-1。种和亚种类主要常见菌种革兰阳性有芽胞杆菌83破伤风梭菌、肉毒梭菌、溶组织梭菌、梭菌属产气荚膜梭菌等革兰阳性无芽胞杆菌丙酸杆菌属8痤疮丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌、贪梦丙酸杆菌优杆菌属34不解乳优杆菌、迟缓优杆菌、粘性优杆菌、短优杆菌等乳酸杆菌属51本菌属与致病关系不大放线菌属12衣氏放线菌、溶齿放线菌、化脓放线菌等蛛网菌属1丙酸蛛网菌双歧杆菌属24两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌等革兰阴性无芽胞杆菌类杆菌属18脆弱类杆菌、多形类杆菌、多形杆菌、普通类杆菌普雷沃菌属20产黑色素普雷沃菌、中间普雷沃菌等紫单胞菌属12不解糖紫单胞菌、牙髓紫单胞菌梭杆菌属16具核梭杆菌、坏死梭杆菌、死亡梭杆菌等纤毛菌属1口腔纤毛菌沃廉菌属2产琥珀酸沃廉菌（来自牛瘤胃）和直线沃廉菌（来自人牙龈沟）月形单胞菌属生痰月形单胞菌（来自人牙龈沟）和反刍月形单胞菌（来自反刍动物瘤胃）革兰阳性厌氧球菌消化球菌属1黑色消化球菌消化链球菌属9厌氧消化键球菌、不解糖化链球菌、吲哚消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌、产生消化链球菌、普氏消化链球菌、四联消化链球菌厌氧性链球菌成微需氧链球菌4麻疹链球菌、汉孙链球菌、多形链球菌、短小链球菌、另外还有已属于口腔链球菌的中间型链球菌和星群链球菌瘤胃球菌属8粪球菌属3八叠球菌属2革兰阴性氧球菌韦荣菌属7小韦荣菌、产碱韦荣菌氨基酸球菌属1发酵氨基酸球菌巨球菌属1埃氏巨球菌二、厌氧菌感染（一）厌氧菌在正常人体的分布厌氧菌在人体的分布非常广泛，正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌。其中肠道中的厌氧菌数量是大肠埃希菌的1000～10000倍。在人体肠道正常菌群中占绝对优势的有A.双歧杆菌B.伤寒沙门菌C.大肠杆菌D.变形杆菌E.无芽胞厌氧菌[答疑编号500735220101]『正确答案』E（二）临床意义1.外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染，其细菌及芽胞来源于土壤、粪便和其他外界环境。少数致病菌能产生强烈外毒素和侵袭性酶，引起人和动物疾病。2.内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。由厌氧菌引起的人类感染在所有的感染性疾病中占有相当大的比例，有些部位的感染如脑脓肿、牙周脓肿和盆腔脓肿等80%以上是由厌氧菌引起的。其中部分系厌氧菌单独感染，大部分系与需氧菌混合感染。3.厌氧菌感染的危险因素1）组织缺氧或氧化还原电势降低，如组织供血障碍、大面积外伤、刺伤。2）机体免疫功能下降，如接受免疫抑制剂治疗、抗代谢药物治疗、放射治疗、化学药物治疗的病人以及糖尿病患者、慢性肝炎患者、老年人、早产儿等均易并发厌氧菌感染。3）机体局部屏障作用破坏：某些手术及创伤，如开放性骨折、胃肠道手术、生殖道手术以及深部刺伤等易发生厌氧菌感染。4）长期应用某些抗菌药物，如氨基糖苷类、头孢菌素类、四环素类等，可诱发厌氧菌感染。5）深部需氧菌感染，需氧菌生长可消耗环境中的氧气，为厌氧菌生长提供条件，从而导致厌氧菌合并感染。4.厌氧菌感染的临床及细胞学指征1）感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发感，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。2）发生在口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等处的感染，易发生厌氧感染。3）深部外伤如枪伤后，以及动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。4）分泌物有恶臭或呈暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。产生红色荧光的分泌物，可能是产黑素普雷沃菌或不解糖紫单胞菌；分泌物或脓肿有硫磺颗粒，为放线菌感染。5）分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而培养阴性者，或在液体及半固体培养基深部生长的细菌，均可能为厌氧菌感染。6）长期应用氨基糖苷类抗生素无效的病例，可能是厌氧菌感染。7）胃肠道手术后发生的感染。三、厌氧菌标本的采集与送检标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。1.采集：采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。采集深部组织标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准确插入病变部位深部，抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处标本量较少，则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。在紧急情况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长。用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。不同部位标本采集方法也各有不同特点，具体方法见表5-22-3。表5-22-3不同部位标本采集方法标本来源收集方法封闭性脓肿针管抽取妇女生殖道后穹隆穿刺抽取下呼吸道分泌物肺穿刺术胸腔胸腔穿刺术窦道、子宫腔、深部创伤用静脉注射的塑料导管穿人感染部位抽吸组织无菌外科切开尿道膀胱穿刺术哪些标本不符合厌氧菌检验要求A.血B.咽拭子C.深部脓肿穿刺液D.牙周脓肿穿刺液E.膀胱穿刺液[答疑编号500735220102]『正确答案』B2.送检方法与处理标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高）。1）针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等。2）无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。3）棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。4）厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质，确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。四、厌氧菌的分离与鉴定检验程序：（一）直接镜检根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。表5-22-4厌氧菌直接镜检初步鉴别菌名革兰染色形态及其他特征脆弱类杆菌G-b两端钝圆，着深色，中间色浅且不均匀，且有气泡，长短不一产黑素普雷沃菌G-b多形性，长短不一，有浓染和空泡，无鞭毛和芽胞。标本有恶臭，琥珀味，紫外线照射发红色荧光具核梭杆菌G-b菌体细长，两头尖，紫色颗粒菌体长轴成双排列，标本有丁酸味坏死梭杆菌G-b高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形韦荣球菌G-c极小的革兰阴性球菌消化链球菌G+c革兰阳性呈链状的小球菌乳杆菌G+b细长，有时多形性，呈单、双、短链或栅状排列痤疮丙酸杆菌G+b排列特殊呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味双歧杆菌G+b多形性，有分支呈Y、V形或棒状，标本有醋酸气味放线菌G+b分支呈棒状、X、Y、V、或栅状，脓汁中有黄色颗粒有琥珀酸气味破伤风梭菌G+b细长、梭形或鼓槌状，有芽胞，有周鞭毛产气荚膜梭菌G+b粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜艰难梭菌G+b粗长杆菌，有芽胞，有鞭毛，近来发现有荚膜c：coccus，球菌；b：bacillus，杆菌。（二）分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。初代培养的一般原则是：（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。（4）尽量保证培养基新鲜。（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。1.选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基；（1）培养基的使用，应注意下列各点：1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。培养基细菌KVLB血平板产黑素类杆菌早期产生黑色素七叶苷胆汁平板（BBE）脆弱类杆菌FS培养基（梭杆菌选择培养基）梭杆菌ES培养基（优杆菌选择培养基）优杆菌BS培养基（双歧杆菌选择培养基）双歧杆菌卵黄（EYA）及兔血平板（RBA）产气荚膜梭菌CCFA培养基（艰难梭菌选择培养基）艰难梭菌VS培养基韦荣球菌2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10%C02环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。3.厌氧培养法（1）厌氧罐培养法。（2）气袋法。（3）气体喷射法：又称转管法。（4）厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一。（5）其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。5.分离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新鲜配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间不足；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。分离培养厌氧菌失败的原因可能是A.厌氧装置的催化剂失活B.标本在空气中放置过久C.培养基不是新鲜配置D.培养基成分不合适E.以上均是[答疑编号500735220103]『正确答案』E6.鉴定试验：可根据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最终鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。（1）形态与染色：可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。（2）菌落性状：不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则的，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。色素、溶血特点以及在紫外线下产生荧光的情况也可以作为厌氧菌鉴定的参考依据。（3）抗生素敏感性鉴定试验：常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑。卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分。甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。（4）生化特性：主要包括多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。目前有多种商品化的鉴定系统可以使用。（5）气液相色谱：可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。五、常见厌氧菌（一）破伤风杆菌1.生物学性状（1）形态与染色：本菌细长，有周鞭毛，无荚膜。芽胞在菌体顶端，呈圆形，使整个细菌体呈鼓槌状。早期培养物为革兰阳性，培养48小时后，尤其是芽胞形成后，易转变为革兰阴性。（2）培养特性：为专性厌氧菌，在普通培养