Cre-loxp基因敲除

01Cre-LoxP重组酶系统1.Cre重组酶•1981年从P1噬菌体中发现，Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码由343个氨基酸组成的38kDa单体蛋白。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。2.LoxP序列•是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA-5'3.Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组过程•如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。•如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。4.Cre-loxP系统的特点•loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；•Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；•Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。•Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；传统基因敲除技术的缺点•knockout小鼠的所有细胞基因组上都存在基因的缺失／突变，往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能的分析。•即使发育完整的突变体小鼠，对于knockout表型的解释常遇到两个困难问题：一是所有体细胞基因的剔除，很难将异常的表型归于哪一类细胞或组织；二是很难排除在成熟动物上由于发育缺陷所引起的异常表型。•新霉素抗性基因(neo)和单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)为正负选择(positiveandnegativeselection)系统，是筛选和富集同源重组细胞广泛应用的方法；该方法虽然使基因打靶技术可适用于任何外源目的基因，但也有一个严重的缺陷，即发生同源重组的细胞基因组中总留有外源的选择标记(neo)基因；该基因可能影响相邻基因的表达，不利于对突变表型的精确分析。以Cre／LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因敲除技术可克服上述的局限性。5.借助Cre-loxP系统的条件性基因敲除一般情况下，利用Cre-loxP系统进行基因操作时，会采用两种转基因动物进行杂交，即一种带Cre的转基因动物和一种带loxP序列的转基因动物进行交配，使得后代既带Cre又带loxP基因，然后Cre重组酶会识别loxP位点，导致基因重组。启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。转基因动物依赖的Cre-loxp系统在应用中遇到的问题•转基因动物的难以获得：有很多Cre/Loxp转基因动物没有被制作出来，自己制作转基因动物耗时且成本高。•动物交配很耗时间：转基因动物达到实验室后，首先需要将转基因动物的数量扩大，然后经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2个月时间，所以至少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠。•区域或者组织特异性不高：因为转基因小鼠依赖的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的调控，而有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求，这样就会使实验结果不精确。6.改良的Cre-loxp系统：病毒依赖的基因重组•通过病毒引入Cre或loxP元件，结合一种转基因小鼠是比较常用的方式。病毒依赖的Cre-loxp系统的优点•更强的区域特异性：由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染，再加上驱动Cre基因的特异性启动子，能够实现更强的区域和细胞特异性的基因重组。•更少的花费：购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的，而且转基因动物的饲养、基因型鉴定都需要不少的人力、物力，而病毒的制备、保存和注射所花的费用相对来说是比较少的。•更短的实验周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而转基因小鼠的交配过程特别耗时间，因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式，可以大量缩短实验周期。7.借助Cre-loxp系统的诱导性基因敲除目前应用于时间特异性基因敲除动物模型的诱导剂大都通过与四环素操纵子（teto）的相互作用来完成诱导过程•在没有四环素类药物诱导时，四环素控制的转录激活蛋白（tTA）与tet操纵子（teto）结合，下游基因发生转录。有四环素时，这种结合消失，下游基因不能转录。•而逆向四环素转录激活蛋白（rtTA）则功能相反，在有四环素时，rtTA与tet操纵子（teto）结合，下游基因发生转录。图注：四环素（Tet）作为诱导剂与逆向四环素转录激活因子rtTA结合，使得下游Cre基因表达，产生的Cre重组酶介导靶基因两侧的loxp序列发生切除效应，从而达到时间特异性基因敲除的目的。谢谢大家