蛋白多肽肺部给药研究进展

蛋白多肽肺部给药研究进展ProgressofPulmonarydeliverysystemofProteinsandpeptides杨林刘莺（湖北省黄石中心医院4350002）摘要：本文介绍了蛋白多肽类药物经肺给药系统的研究进展，综述了新型肺部给药系统、提高蛋白多肽类药物生物利用度的方法以及此类药物经肺给药的评价方法取得的研究进展。Abstract:Thedevelopmentofpulmonarydeliverysystemofproteinsandpeptideswereintroduced.theresearchingonthenewpulmonarydeliverysystems、methodsinincreasingthebioavailabilityandevaluationmethodsofpulmonarydeliveryofproteinsandpeptideswerealsoreviewedinthisartical.Keywords:proteinsandpeptides;newpulmonarydeliverysystems;bioavailability;evaluationmethods蛋白质和多肽药物制剂的研究和开发，是医药工业中的一个重要的领域。但一方面，蛋白多肽类性质不稳定，极易变质；另一方面，这类药物对酶敏感又不宜透过胃肠粘膜，只能注射给药，但存在体内半衰期短，安全性差且使用很不方便。肺部作为药物的有效吸收部位，具有巨大的表面积(约100m2)，为体表面积的25倍，可高效递送分子量较大的蛋白质和多肽类药物;肺泡囊壁有单层上皮细胞所构成，这些细胞紧靠着致密的毛细血管网（毛细血管总面积约为90m2，且血流量大），气血屏障较小,只有0.5μm左右，药物通过空气血液途径交换的距离很短,速度也很快；酶水平低，能避开胃肠道对药物的不利影响。因此，运用肺部给药的制剂手段提高蛋白多肽类药物的稳定性及患者使用的顺应性、安全性，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景。本文对这类药物肺部给药做一综述，介绍蛋白多肽类新型肺部给药系统，及提高其生物利用度的方法和评价方法的研究进展。1新型肺部给药系统1.1.1吸入粉雾剂吸入粉雾剂(又名粉雾吸入剂,干粉吸入剂,粉雾剂)是1种或1种以上的微粉化药物与载体(或无)以胶囊、或泡囊等多剂量储库形式,经特殊的给药装置给药后以干粉形式进入呼吸道,发挥全身或局部作用的一种给药系统[1]。1.1.2吸入粉雾剂具有以下特点:①易于使用,患者主动呼吸启动，可以克服药物释放和吸入不协调的问题;②无抛射剂氟里昂,可避免对大气环境的污染;③药物可以胶囊或泡囊形式给药,剂量准确,且不受定量阀门的限制，最大剂量高于气雾剂;④药物呈干粉状,稳定性好,干扰因素少,尤其适用于多肽和蛋白类药物的给药。目前用于全身治疗的蛋白多肽类药物有胰岛素,重组人生长素,亮丙瑞林醋酸盐,鲑降钙素;用于局部治疗的有白介素,干扰素,环孢素A等[2]，其中胰岛素粉雾剂的研究一直是该领域的热点[3]。,2006年初,美国FDA首次批准了辉瑞、安万特公司联合开发的胰岛素吸入剂Exubera~(TM)上市,这是糖尿病治疗史上的里程碑。Codrons等【4】制备了甲状旁腺激素(PTH)的DPI(干粉吸人剂)，并评价了其对小鼠于粉给药的有效性和安全性。处方由PTH、糖类、二棕桐酞磷脂酞胆碱和(或)白蛋白，通过喷雾干燥法制备，制得干粉粒径4.5μm，堆密度0.06g/cm，平均空气动力学粒径3.9-5.9μm，体外沉积量实验中,使用Spinhaler吸入器，排空率达98%，好粒子份数为61%。PTH干粉处方气管内给药的绝对生物利用度为21%，而皮下注射给药的绝对生物利用度为18%。在单次吸人后48h,肺内无慢性感染。由此可见优化PTH的干粉吸人剂处方，可使其干粉吸人剂代替皮下注射剂成为可能。吸入装置是吸入粉雾剂成功研发的关键，但目前没有产品能完全满足完美吸入装置的要求。在粉雾剂领域，装置的设计是是值得进一步研究所在。1.2微球制剂制成生物可降解的微球制剂，可以使蛋白多肽类药物控制释放。常用的材料有蛋白质、淀粉、乳糖、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)以及聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA）等。目前作为注射制剂，已有经FDA批准的此类药物微球制剂醋酸亮丙瑞林聚丙交酯-乙交酯微球。此类微球用于治疗前列腺癌，可控制释放达30天之久。新型微球可控制微粒大小在0.5-5μm范围，具有适宜的吸入特性，Grenha等[5]将典型的干粉吸入剂辅料甘露醇和乳糖溶于水后,加入到载有蛋白质的壳聚糖纳米粒混悬液中，以2.5mL/min的加料速率通过0.7mm口径的喷嘴进行喷雾干燥，以甘露醇和乳糖为辅料的入口温度分别为160℃和135℃，出口温度分别为108℃和85℃，进风量分别为400和320NL/h。结果，得到的微球大多数为球形，直径在1.9~4.0μm之间，具有适合于肺部给药的空气动力学性质，其形态受壳聚糖纳米粒用量的影响很大；这些纳米粒表现出很好的蛋白载药量(65%~80%)，并能在15分钟内释放75%~80%的胰岛素。还可以制成直径5μm以上、密度小于0.4g/cm3的大孔微球载体给药系统(LargePorousParticles,LPPs)。LPPs微粒较大，易在肺部沉积，从而是药物在肺部缓慢释放。Oliveira等[6]制得的壳聚糖微球再与可生物相容、无毒的d，l-甘油醛进行交联，最终所得微球形态好，平均粒径约为13.4μm，粒度分布窄，可用于控释给药。阿尔科姆斯(Alkermes)公司和礼来公司联合开发的AIRÒ系统是多孔性微球肺部给药制剂。在一项随机开放标记的多中心研究中,患者使用AIRÒ系系统,与皮下注射比较,显著获得更高的治疗满意度(P0.01)。[7]Wang等[8]研究了胺化明胶包裹的胰岛素微球，体外释放研究发现较明胶微球具有更好的缓释性，胺化明胶与明胶的微球30min内体外药物释放率分别为18.4%、32.4%,8h内为56.9%、75.1%，体内研究表明胺化微球具有较好的降血糖作用。胺化后具有更好的缓释性可能是由于正电荷微球与胰岛素(等电点6.0,在pH7.4缓冲液中带负电)之间的静电作用，延缓了药物释放。1.3脂质体近年来针对多肽蛋白类药物脂质体肺部给药的研究受到了普遍关注。肺泡表面活性物质主要由磷脂组成，脂质体同样是由磷脂双分子层构成，两者生理相容性良好，脂质体肺部给药不易引发毒性和免疫反应且具有吸收迅速、刺激性小、耐受性好、安全性高，可实现持续缓慢释药、生物利用度高等优点。该类载药脂质体的肺部给药比小分子药物更具挑战性，雾化过程中不仅要保持构象完整，还要防止其化学分解和泄漏。在具有完全生物活性的胰岛素脂质体中加入微量PEG-DPPE可使其形成三维立体空间，物理稳定性增强[9]。体内实验中以荧光探针作为标记物，观察到雾滴可均一沉积在小鼠肺泡表面；外源性脂质体的加入，加速了肺泡表面活性剂的循环过程，增加了吸收进入体循环的蛋白质分子数量，生物利用度提高，有效降低了小鼠血糖水平；雾化吸入胰岛素溶液和空白脂质体的混合物，较胰岛素溶液的吸收也有所增加。将模型药物β-葡糖苷酸酶(GUS)脂质体以甘露醇作为保护剂冻干粉碎后，GUS的含量和活性分别为原来的36%和22%，药物的四级结构在该过程中被破坏而造成部分失活；推测其主要原因是甘露醇作为单糖易结晶，在干燥状态下造成相分离，破坏脂质体的稳定性[10]。加入2.5%高分子量PVP，能提高玻璃态转化温度(Tg)，药物活性可保持67.3%，因此冻干保护剂的选择对大分子药物尤为重要。1.4纳米粒为了保护一些蛋白多肽类药物不被破坏，有人用纳米粒包裹药物进行肺部给药。但是，由于纳米粒粒径较小，容易被排出体外。为解决这个问题，YamamotoH等[11]对纳米粒进行了表面修饰，取得了很好的效果。他们用壳聚糖修饰了包裹降钙素的纳米粒，发现经修饰后，纳米粒可以黏附在呼吸道黏膜上，药物释放可延长到2周以上，而此时纳米粒中还有40%的药物未释放；未经壳聚糖修饰的纳米粒，则很快被清除，其从呼吸道的清除速度是前者的3倍。这可能是由于壳聚糖可以黏附在肺黏膜的内皮细胞上，阻止了呼吸道纤毛对它的清除作用，增加了它在呼吸道的滞留时间。另外，经修饰的纳米粒降低血浆钙的时间可持续24h以上，并且其降低血浆钙的能力明显高于未经修饰的纳米粒，这可能与壳聚糖能打开内皮细胞间的紧密连接，从而促进了药物的吸收有关。2提高蛋白多肽类药物生物利用度的方法2.1吸收促进剂2.1.1胆酸盐类表面活性剂主要包括胆酸钠、去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠和去氧甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和去氧牛磺胆酸钠等。1%胆酸盐类的乙醇溶液促进胰岛素吸收作用大小顺序为:去氧胆酸钠胆酸钠甘胆酸钠去氧甘胆酸钠去氧牛磺胆酸钠,均高于无胆酸盐组。2.1.2脂肪酸盐和非离子型表面活性剂实验证明,脂肪酸盐和一些非离子型表明活性剂可增加蛋白质和多肽类药物的吸收。2.1.3载体近年来,新式促进剂得到了开发和应用，其中一种被称为载体的吸收促进剂类似分子伴侣，可逆的打开折叠的蛋白质分子链，使其内部疏水链外露，分子表现出一定的脂溶性，便可以通过跨细胞途径穿过细胞膜，一旦实现协助转运,药物和载体即分离，疏水链复位，蛋白空间结构得以恢复。这种载体仅作用于药物本身，对细胞膜结构和功能不产生任何影响，是一种安全高效的吸收促进剂。2.1.4细胞穿透肽细胞穿透肽是从艾滋病毒转录启动子中首先发现的。它可以通过干扰脂质双分子层的结构或者细胞内吞来实现吸收促进作用的，毒性远小于传统的吸收促进剂。2.1.5其他类糖类、稀土元素化合物、羟甲基丙氨酸、透明质酸都可用作吸收促进剂提高蛋白多肽类药物肺部给药的生物利用度。2.2化学修饰蛋白多肽的结构修饰化学修饰可改变蛋白质和多肽分子的性质，如修饰剂主要有右旋糖苷、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多聚唾液酸、PEG等,其中以PEG类修饰剂最为常用。用PEG修饰多肽月桂酸、修饰TRH,棕榈酸修饰胰岛素后，都可减少酶对这些大分子物质的破坏，提高生物利用度[12-13]。3评价方法3.1体内评价临床前阶段体内评价通常使用大鼠、兔等动物,以气管滴注的方法或一定的装置给药。肺部给药的蛋白多肽类药物多为内源性激素或其类似物、拮抗剂,治疗剂量小,效应大,评价时多采用药动学和药效学相结合的方法。此外,药物颗粒是否能到达呼吸道的深部是药物发挥作用的前提,因此需要对药物在呼吸道各部位的沉积进行考察,通常用肺内沉积量反映。3.1．1药动学评价使用放免法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)等灵敏度高、特异性强的方法测定血药浓度，从而测定蛋白多肽类药物经肺给药后的生物利用度。3.1.2药效学评价肺部给药的蛋白多肽类药物多具有强烈和明显的生物效应，检测其生物效应，确定一药理作用指标,用类似于梯形法计算生物利用度的方法求算药理相对生物利用度。3.1.3肺内沉积药物在肺内的有效沉积取决于药物粒子的惰性嵌入、沉降及扩散。粒径小于1μm的粒子则容易随呼气排出，粒径大于3μm的粒子易沉积在口咽部,从而造成药物损失，生物利用度低。药物在肺内的有效沉积的常用评价方法为γ-闪烁扫描法。有人制备了鲑降钙素的吸人粉雾剂，并考察其药剂学性质。【14】利用喷雾干燥法制备干粉处方，体外沉积量实验结果显示，排空率在90%以上，有效部位沉积量在10%以上；在相对湿度52%以下，粉粒呈圆形的分散状态；粉体平均粒径为1.67μm，其药剂学性质良好。3.2安全性评价目前蛋白多肽类药物肺部给药系统存在的主要问题之一就是长期给药后的安全性评估。蛋白多肽类药物经肺给药后可能被机体识别为抗原而产生免疫反应,此外为了提高吸收效果而加入的吸收促进剂和酶抑制剂以及递送系统所应用的微粒也会引起安全隐患。肺部作为生命活动无法替代的器官,多次和长期给药，特别是蛋白多肽类的大分子药物，如对肺部的造成轻度损伤将直接引起呼吸功能不可逆性损伤,直至影响呼吸功能而威胁生命。通常短期用药的安全性评价使用组织病理学的研究方法,长期安全性评价则依赖多中心的临床试