第11章-生物催化

第三部分化学生物学的应用和延展第11章生物催化本章内容生物催化的定义生物催化的基本性质生物催化的筛选以及改造人工酶1234生物催化的应用5概述生物催化世界各大生物技术公司竞相追逐的和研发的热点，高效、专一、条件温和、环境友好，实现绿色化学。国家中长期科技发展规划和863计划均增列了生物催化和生物转化专题;中石化、中石油、中粮集团等国有大企业集团受到吸引，纷纷投资开发生物能源、生物材料与生物质化学品的工业技术。酶的发现1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。酶在生产和生活中应用酿酒工业中使用的酵母菌，就是通过有关的微生物产生的，酶的作用将淀粉等通过水解、氧化等过程，最后转化为酒精；淀粉葡萄糖酒精Enzymesareusedinboththealcoholandstarch-processingindustriestohydrolyze(breakdown)largestarchmoleculesintosimplesugars.Thydrolysisofstarchtosimplesugarsisaccomplishedbyusingatwo-step,enzyme-catalyzedprocesscalledliquefactionandsaccharification.洗衣粉中加入酶，可以使洗衣粉效率提高，使原来不易除去的汗渍等很容易除去洗衣业常用的酶有四种:脂肪酶/蛋白酶/淀粉酶和纤维素酶.11.2生物催化的定义利用酶或者细胞等具有生物活性的物质催化化学反应的技术学科，这种反应过程又称为生物转化。常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化。生物催化生物学工程学化学有机化学生物化学生物无机化学分子生物学蛋白质化学化工催化反应工程11.3酶催化的基本性质11.3.1酶催化动力学原理酶在催化过程中通过变化构象，降低反应的能垒，催化反应进行。酶反应动力学模型E+SESE+PE游离酶浓度S底物浓度P产物k2k1k-1米氏方程通过Km和Vmax调整生物催化工艺11.3.2催化机理1.锁钥学说（Fisher，1894）：酶的活性中心结构与底物的结构须非常吻合，如同锁和钥匙一样,紧密结合成中间络合物。底物S酶E酶-底物复合物ES锁钥学说EnzymeCatalysts诱导契合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的柔性,当底物与酶分子结合时,诱导酶蛋白的构象发生有利于与底物结合的变化,使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向,转入有效的作用位置,这样才能使酶与底物完全吻合,结合成中间产物。SEE-S复合物abcabcES诱导契合学说11.3.3酶催化的性能指标选择性酶活性稳定性区域选择性化学选择性立体选择性影响酶促反应速度的因素－－酶促反应动力学酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶浓度[E]底物浓度[S]反应温度pH值激活剂抑制剂(1)酶浓度对酶反应的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。当底物浓度较低时反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应[S]VVmax(2)底物浓度对反应速率的影响随着底物浓度的增高反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应[S]VVmax（3）pH对酶作用的影响2.最适pH1.pH稳定性－－酶表现最大活力的pH值。在一定的pH范围内酶是稳定的。一些酶的最适pH值酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8酶的最适pH只在一定条件下才有意义酶的最适pH不是固定的常数,其数值受酶的纯度、底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等影响pH影响酶活力的原因：1.环境过酸、过碱可使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶变性失活；2.pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化；3.pH影响底物有关基团的解离。（4）温度对酶作用的影响两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，热变性速度加快。Tv最适温度酶的最适温度:在一定条件下，酶表现最大活力时的温度。酶的最适温度不是一个固定的常数，其数值受底物种类、作用时间等因素影响而改变。（5）激活剂对酶作用的影响激活剂：能提高酶活力的物质。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。激活剂无机离子大多为金属离子:如K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+等少数为阴离子:如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等小分子有机物：如Vc,Cys,GSH,胆汁酸盐等生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等（6）抑制剂对酶作用的影响抑制剂：使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质。由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为抑制作用（inhibition）。凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用（inactivation）。11.3.4酶活力的测定与酶的制备一、酶活力的测定酶的活力：酶加速其所催化的化学反应速度的能力。酶促反应速度越大，酶的活力就越强；反之，反应速度越小，酶的活力就越弱酶反应速度的测量(1)测量单位时间内底物的消耗量。(2)测量单位时间内产物的生成量。产物生成量时间测定酶活力时必须要注意：（1）测定的反应速度必须是反应初速度。否则，不可能得到准确结果；（2）酶反应速度受环境条件的影响。在测定酶活力时，要维持在一套固定条件下进行２.酶活力单位—表示酶量多少的单位在一定条件下（温度保持在30℃，其他条件如pH和底物浓度等，均应采用最适条件）一分钟内能转化1μmol底物的酶量称为一个酶单位（U）。３、酶的比活力比活力（比活性）每mg蛋白质中所含的活力单位数。酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是表示酶制剂纯度的一个指标。如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。二、酶的制备不同使用目的，要求酶制剂的纯度高低不同，如科学研究常需要高度纯化甚至制成结晶。酶绝大多数是蛋白质，故一般常用的酶的分离纯化方法，也就是常用来分离纯化蛋白质的方法。特别需要注意：酶具有催化活性，在整个提纯过程中，要防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等，以避免酶活力的损失。酶的分离纯化步骤1.选材：选用酶含量高的材料工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量也丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。生物体所产生的酶有胞内酶和胞外酶之分，所以在处理方法上有所不同。如果是胞内酶则需要先用捣碎、砂磨、冻融或自溶等方法将细胞破坏，然后再用适当的盐溶液或缓冲液把酶提取出来——抽提如果是胞外酶，则无需破坏细胞的手续，而直接用体液如唾液、胃液、乳汁或微生物的发酵液进行纯化2.破碎细胞：机械破壁，化学破壁，酶破壁，冻融破壁等3.抽提:用适当的盐溶液或缓冲液把酶提取出来4.分离及纯化一些常用的分离纯化酶的方法：（1）盐析法最常用的盐是硫酸铵、氯化钠和硫酸钠等（2）有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮等能与水互溶的有机溶剂，在不同的浓度下能沉淀不同的蛋白质，因此可用来纯化酶。此法分辨能力高，提纯效果好。但高浓度的有机溶剂常引起酶活力的丧失,同时整个操作过程都应该严格控制在低温进行判断分离提纯方法的好坏，一般用两个指标来衡量:一是总活力的回收——得率（回收率）二是比活力提高的倍数总活力的回收是表示提纯过程中酶的损失情况；比活力提高的倍数则表示提纯方法的有效程度。5.保存：低温干燥保存11.3.5酶的应用工业上酶应用的优点：1.酶的催化效率高，专一性强，不发生副反应。2.酶作用条件温和。3.酶及其反应产物大多无毒性。固定化酶把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。（一）为什么要固定化酶（二）酶固定化的优缺点（三）酶的固定化方法（一）为什么要固定化酶传统酶缺点①传统酶催化反应几乎都在水溶液中进行，只能一次性使用，难以回收②酶与产物混合，增加产物分离和纯化难度③溶液中酶的稳定性差，容易变形和失活。而将酶固定化能够克服这些缺点相对于酶直接加入至溶液中，通常将固定化酶的制备过程称为酶的固定化。该项技术于20世纪60年代发展起来的，1971年第一届国际酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。（二）酶固定化的优缺点1、酶固定化的优点：①可以重复使用，在大多数情况下，稳定性明显提高②催化后，酶与底物容易分开，产物易于分离纯化，质量提高③反应条件易于控制，可实现反应的连续化和自动控制④酶的利用效率高了，单位酶量催化的底物浓度增加，而酶量减少⑤更适合于多酶催化反应2、固定化酶的缺点①存在着酶失活现象，尤其是共价法固定②消耗固定化材料，增加成本③酶被固定到载体后将增加底物和产物的传质阻力考虑固定化酶的优缺点，在工业采用固定化还是液态。吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。（三）酶的固定化方法(四)固定化对酶稳定性的影响大多数酶在固定化以后，有较高的稳定性和较长的有效寿命。其原因是：固定化增加了酶结构的牢固性程度；阻挡了不利因素对酶的侵袭；限制了酶分子的相互作用。1、增加热稳定性2、增强对变剂性、抑制剂的抵抗能力3、固定化减轻蛋白酶的破坏作用4、半衰期延长固定化对酶稳定性的影响酶在医学上的应用---(1)酶与疾病的发生酶缺乏或异常引起的疾病酶疾病苯丙氨酸羟化酶苯丙酮酸尿症6-磷酸葡萄糖脱氢酶蚕豆病酪氨酸酶白化病细胞色素氧化酶氰化物中毒胆碱酯酶有机磷中毒（2）酶与疾病的诊断——血清酶活性测定酶主要临床应用谷丙转氨酶肝实质疾患谷草转氨酶心肌梗塞、肝实质疾患乳酸脱氢酶心肌疾患、肝实质疾患碱性磷酸酶骨病、肝胆疾患胰蛋白酶(原)胰腺疾病肌酸激酶心肌梗塞、肌肉疾患醛缩酶肌肉疾病（3）酶与疾病的治疗替代治疗：消化不良--胃酶、胰酶抗菌治疗：清创--糜蛋白酶、胰蛋白酶对症治疗：预防血栓形成--尿激酶、链激酶抗癌治疗：氨甲喋呤—还原酶11.4生物催化剂的筛选以及改造生物催化剂的来源一、从微生物体系内筛选并提取生产，是目前使用最广泛的获得手段；二、通过DNA重组技术或蛋白质工程方法获得。11.4.1生物催化剂的筛选空气、土壤、水强酸、强碱、高温、高压微生物生存的环境多样产酶微生物的发现筛选分离微生物和酶的筛选办法（1）从自然界发现产酶微生物筛选步骤采集富集复筛分离粗筛选择合适的培养基获得人工环境下的优势菌株筛选分离菌株的筛选过程发酵平板筛选组合条件复筛（2）优良菌株选育自然选育诱变选育自然选育根据微生物自身的突变达到选育的过程，缺点是效率较为低下。诱变选育通过人为改变生长环境的方法促使微生物发生基因突变或染色体畸变，达到菌种选育。诱变生长条件筛选高产菌株抗性代谢温度筛选方式营养缺陷型突变株筛选抗反馈阻遏和反馈抑制突变菌株筛选组成型突变菌株筛选抗性突变菌株筛选营养缺陷型突变株筛选指微生物不能在无机盐类和碳源组成的合成培养基中增殖，必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。影印法反馈抑制：一种负反馈机制，其中酶促反应的末端产物可抑制在此产物合成过程中起作用的酶。反馈阻遏：主要在