枸杞组培快速繁殖技术研究

枸杞组培快速繁殖技术研究①本文通过对“宁杞２号”枸杞离体组织培养的研究，进行了丛生芽诱导，试管母本的建立，嫩梢增殖，生根状况分析及其移栽等方面的探讨，进而探索了组培快速繁殖以及生产上适用的组培技术，结果表明：改良ＭＳ＋ＢＡ０．２＋ＫＴ０．３＋ＮＡＡ０．５和改良ＭＳ＋ＢＡ０．７５＋ＮＡＡ１＋ＩＢＡ０．１交替使用，可加快增殖速度；以较短的根系移栽试管苗，既省工、省力，又能提高成活率，从而确立了一套较为理想的快速繁殖体系，为大规模工厂化育苗提供了可靠依据②选用“宁杞2号”离体组织进行了愈伤组织诱导和生根状况的研究．筛选出了适宜的愈伤组织诱导和生根的培养基．结果表明，最适的愈伤组织诱导培养基为1／2MS＋BA1．0mg／L＋NAA1．0mg／L,最适的生根培养基是；1／2MS＋NAA0．6mg／L＋IBA0．2mg／L．③本试验以枸杞嫩枝及顶芽作外植体进行组织培养。结果表明,不定芽诱导用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;增殖培养基以MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L较佳;生根培养基为1/2MS(大量元素减半,其它成分不变)+IBA0.1mg/L+活性碳0.1%。④植物名称:宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)材料类别:多年生植株上当年萌生出的嫩枝茎尖。培养条件:基本培养基为MS。长芽培养基中的激素成分为(毫克/升):①IAA0.5,KT1,②IAA0.5,BA1。蔗糖浓度为3％。生根培养基成分为1/2MS(大量元素减半),附加Zt0.2,NAA0.4,蔗糖浓度2％。培养温度25～30℃,自然光照。⑤MS和MS(1/2大量、微量元素全量)培养基均适于枸杞的培养、芽增殖和发根.在培养基的附加成分中激素的调节是重要的,激素以IBA浓度在0～1.1×10-6mol/L均适其培养,但以IBA的浓度为5.5×10-7mol/L效果最佳,在有机成份中VB1的含量对发根有明显的促进作用.微量全量对枸杞的发根是必需的.MS(1/2大量、微量元素全量)+VB12.96×10-5mol/L+IBA5.5×10-7mol/L(其他有机成分常量)是枸杞芽增殖与发根同步的最佳培养基.⑥枸杞属植物(LyciumhaminifoliumMill)花粉粒发育成胚和植株的形成已有报导。本文报导枸杞叶外植体的愈伤组织诱导及其植株的再生。从未开花植株上摘取无病虫害的叶片作材料,先用流水冲洗除去尘土,然后在70％的酒精中浸20秒左右,再在含万分之二昇汞和5％安替福民的溶液中消毒4～5分钟(消毒时间不能过长,以免伤害叶片)。用无菌水淋洗3～5次后,在无菌条件下将叶片横切成1厘米左右的切段,接种在Murashige和Skoog培养基上,培养基附加激动素(K)2.0,吲哚乙酸(IAA)2.0或K4.0,IAA枸杞髓组织离体培养及高频率植株再生的研究*曹有龙陈放罗青曲琳摘要：枸杞髓组织在4种MS培养基上都能诱导出愈伤组织，诱导率53.7%～100%。在培养基MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L获得的愈伤组织，呈颗粒状，分散性能好，胚性细胞多。将其转移到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L的分化培养基上获得大量绿色小芽，小芽在MS+6-BA0.2mg/L的培养基上得到快速繁殖，繁殖系数50～150株/芽.月。丛生芽在MS+NAA0.2mg/L的培养基上形成完整植株。关键词：枸杞；髓组织；离体培养；植株再生枸杞（LyciumbarbarumL.）是重要的药用植物，多年来，国内外科技工作者十分重视枸杞的组织培养，已有用叶片、花药、下胚轴、茎端及幼嫩子房为材料进行组织培养分化出植株的〔1,2,3〕，我们在此基础上，以枸杞髓组织为试验材料进行组织培养，获得了再生植株，为枸杞细胞突变体的筛选、细胞悬浮培养、原生质分离、细胞杂交、基因转移的研究提供依据。1材料和方法1.1试验材料供试材料为宁夏农科院枸杞研究所培育的高产优质枸杞新品种——宁杞１号。1.2.1愈伤组织的诱导取当年生长的明显分化成髓组织的枝条，摘除叶子、侧芽和带有分生组织的顶端100mm，把外植体的切端蘸熔蜡封着伤口，然后浸入70％酒精中20s，再转入0.1%HgCl2溶液中，经过8～10min后，用无菌水冲洗3遍，最后以吸水纸吸干，从茎的两端各切除10mm，余下部分切成20mm的小段，用无菌镊子夹着茎的切段，用瓶塞打孔器从切段中取出圆柱体髓组织，并将其转移到90mm的无菌培养皿中，用解剖刀切成2～3mm厚的小圆片，接种到4种含不同激素的MS固体培养基上诱导愈伤组织发生。1.2.2愈伤组织的继代培养在P2培养基中加入500mg/L的水解酪蛋白作为继代培养的培养基。挑选色泽鲜艳、生长迅速的愈伤组织进行继代培养，每次20d，2～3次继代后，出现疏松颗粒状胚性愈伤组织，选择颗粒较细的愈伤组织，加快继代频率（2周1次），当愈伤组织易碎，颗粒均匀且生长迅速时，改为3周1次保存之。1.2.3分化培养将上述继代过程中产生的胚性愈伤组织转移到含不同浓度的6－BA和NAA的MS培养基上，4周后观察不同培养基上愈伤组织的分化出芽情况。1.2.4生根培养选择较为健壮的丛生芽，切除底部的叶片，只保留上部2～3片叶，插入生根培养基中，3周后观察其生根情况。在上述各步骤中，各外植体均接种于容量为120ml的三角瓶中，每瓶3～4个外植体，每处理3～4次重复。培养条件：温度20～25℃，每日光照10～12h，光照强度为2500～3000lx。2结果与分析2.1愈伤组织的诱导和生长枸杞髓组织切片接到诱导培养基上3d后开始膨大，在切面上开始形成白色愈伤组织（图版Ⅰ:1），其中P1培养基诱导频率最高，可达95.7%；P3与P4培养基诱导的愈伤组织白色紧密，不易分散，经过30d继代培养，有的可直接分化出苗，但频率很低（表1），而P2培养基上诱导的愈伤组织为淡黄色松散型，这种愈伤组织继代转接后能迅速生长，多次继代培养后，颗粒小，分散好，难以用镊子夹起来，而且胚性细胞多，分化频率高。表１枸杞髓组织在不同激素配比培养基上的诱导情况Table1EffectsofhormonesoncalliinductionofLyciumbarbarumL.pithtissue培养基编号No.ofmedium培养基组分(mg/L)Contentsofmedium开始启动时间(d)Timeofcalliproduced接种块数(块)Numberofexplantsplanted出愈块数Numberofexplantswithcalliinduction诱导频率(%)PercentageofcalliinductionP1MS+2,4-D0.539595100P2MS+6-BA0.1+NAA0.510957578.9P3MS+6-BA0.5+NAA0.514957073.7P4MS+NAA0.1+KT0.514955153.72.22,4-D对愈伤组织继代的影响在P1培养基中，我们加入植物激素2,4-D0.5mg／L诱导愈伤组织发生，诱导率为100%。这说明2,4-D对枸杞愈伤组织的诱导有一定的促进作用，将其转入含不同激素成分的培养基中进行继代培养，结果如表2。表22,4-D对枸杞愈伤组织的影响Table2Effectsof2,4-DoncalliofLyciumbarbarumL.培养基编号No.ofmedium激素浓度(mg/L)Hormoneconcentration生长情况Growthstatus褐化时间（d）Timeofcallibecomebrown愈伤组织特点Callicharacteristics（1）MS+2,4-D2++++10白色水质状，生长快（2）MS+2,4-D1+++12白色水质状，生长快（3）MS+2,4-D0.5++25白色松散，生长较快（4）MS+2,4-D0.5+CH++28白色松散，生长较快（5）MS+2,4-D0.5+KT0.5+2白色紧密，颜色由白转绿（6）MS+NAA0.5+6-BA0.5+++－淡黄色，颗粒状注:愈伤组织生长情况分四级:+很少++少+++中等++++大量Fourclassesweredividedaccordingtothecallusgrowth:+verysmall++small+++medium++++large.表2可以看出,2,4-D对枸杞愈伤组织的形成在一定范围内(0.5～2mg／L)随2,4-D浓度的增加,愈伤组织生长加快,但褐化时间提前。当0.5mg／L2,4-D与0.5mg／LKT配合使用时，愈伤组织生长速度很低，而且变得十分坚硬，颜色也由白色转为绿色，近培养基部分2d后出现褐化；培养基中添加500mg／LCH对愈化组织的生长有很好的促进作用。当把培养基含2,4－D0.5mg／L诱导出的愈伤组织转接到P2培养基后，愈伤组织逐渐转变为颗粒状胚性愈伤组织，与P2培养基上诱导的愈伤组织物质很相似(图版Ⅰ:2)。因此，如果用含2,4－D0.5mg／L的培养基诱导愈伤组织发生，用P2培养基进行继代培养，将获得大量颗粒状胚性愈伤组织。因此，这种方法是枸杞进行离体快繁较为适宜的途径。表3不同植物激素对枸杞愈伤组织分化频率的影响Table3EffectsofdifferenthormonesondifferentiationrateofLyciumbarbarumL.calli培养基(mg/L)Medium分化频率（％）Regenerationrate每块愈伤组织平均的苗数（个）Averagenumberofshootsonasinglecallus特征Characteristics6-BA210012大多数玻璃化6-BA19010部分玻璃化6-BA0.5978正常6-BA0.5+NAA0.59010芽基部有愈伤组织产生6-BA0.5+NAA0.019311正常2.3分化培养将经过P2培养基进行继代培养15d的愈伤组织转入附加3%蔗糖、0.8%琼脂，500mg／LCH,pH5.8～6.0含不同6-BA浓度的MS分化培养基，两周后开始形成芽点，可进一步发展成芽丛(图版Ⅰ:3），所做不同植物激素配比试验结果表明，枸杞愈伤组织芽的分化需要一定浓度使用的5种含6-BA的培养基分化频率都在90％以上，6-BA浓度高,每块愈伤组织得苗数多,但玻璃化苗也多,6-BA与NAA配合使用,能显著提高愈伤组织的分化频率,但同时愈伤组织也得到增殖,分化得到的苗必须及时转移，否则苗的基部又会转化为愈伤组织。单独使用6-BA，浓度为0.5mg／L或者附加NAA0.01mg／L时愈伤组织分化频率略为下降，但分化出的苗正常，比较几种培养基分化出苗的结果，以MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.01mg／L结果最好(表4)。表4枸杞芽的扩繁Table4Reproductionofbuds培养基Medium繁殖系数（株／月.芽）Coefficientofreproduction特征CharacteristicsMS+6-BA10-5转变为玻璃化苗MS+6-BA0.510-30部分有玻璃化现象MS+6-BA0.250-150正常苗2.4芽的扩增在愈伤组织上分化形成的芽，等长到2cm高时，将其沿基部切下，转入含不同6-BA浓度的培养基中，使其扩增，结果如表5。从表5可以看出，以MS+6-BA0.2mg／L时，芽生长正常，经过20d的培养，每芽可产生50～150株无根苗（图版Ⅰ：4），但BA为1mg／L时，芽不能进行扩增，培养20d后就转变为玻璃化苗，6-BA0.5mg／L的培养基虽能进行扩繁，但随着培养时间的延长，部分也转化为玻璃化苗。2.5生根培养将丛生芽沿基部切下，接种到生根培养基上诱导生根，结果如表5．表5不同植物激素浓度对枸杞幼芽生根的影响Table5EffectsofdifferenthormonesofLyciumbarbarumL培养基（mg／L）Medium接种苗数（个）Numberofplantedshoots生根芽数（个）Numberofshootswithinduced