第八章 植物脱毒技术2

植物组织培养GoodMorning第八章植物脱毒技术一.病毒在植物体内的分布及危害；二.植物脱毒的意义三.植物脱毒的原理和方法；四.植物脱毒苗的鉴定；五.植物脱毒苗保存、应用与繁殖教学内容目的与要求：了解：1、病毒在植物体内的分布及危害。理解：1、脱毒苗的意义；2、植物脱毒苗的鉴定、保存、应用与繁殖。掌握：1、无病毒苗概念；2、植物脱毒的原理和方法。。病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病毒苗，实施农作物无病毒化栽培。无病毒苗是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。脱毒后的马铃薯苗一.病毒在植物体内的危害及分布1.危害:绝大多数植物都可以无性繁殖的,容易受到多种病原菌的侵染,体内积累浓度相当高的病毒。在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。病原菌的侵染不一定会造成植物的死亡,却会大大降低植物的生长发育及产量和质量,从而影响其栽培的经济效益。因此,脱除病毒及其他病原菌对植物栽培生产是非常必要的。一.病毒在植物体内的危害及分布2.分布在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。–老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高–根尖、茎尖生长点约0.1~1mm区域内，几乎不含病毒。（原因？）(原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。)二、植物脱毒的意义任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。1、能够有效地保持优良品种的特性2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用◆离体繁殖周期短◆不受季节限制◆繁殖系数高◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的又称之为快繁3、生产无病毒种苗，防止品种退化受病毒危害严重的作物：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰4、节约耕地，提高农产品的商品率块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例：◆大蒜：留种量占产量的五到八分之一◆马铃薯：留种量占产量的十分之一◆贝母：留种量占产量的三分之一(贝母：多年生草本植物,其鳞茎供药用,有止咳化痰、清热散结之功。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地)5、便于运输常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。以马铃薯为例：按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有2kg（每个0.5g）。三、植物脱毒的原理和方法（一）植物脱毒原理：1）植物病毒本身不具有主动转移的能力。在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制；3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。（二）植物脱病毒方法物理方法化学方法生物方法高温处理茎尖培养微体嫁接珠心培养愈伤脱毒热处理脱毒1.热处理脱毒法热处理脱毒原理病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。热处理方法（1）愈伤组织热处理离体培养愈伤组织热处理继代分化培养。常用温度及时间：低温37—38℃处理2周、4周或8周；高温50℃处理3—5min。（2）热空气处理脱毒法试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。生长室温度35-40℃光照3000—10000lx热处理的优缺点优点:方法简单，效果明显。缺点:1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。其它效果•香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。2.组织培养脱毒法包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒。（1）微茎尖培养脱毒法脱毒效果好后代遗传稳定使用最广泛的一种方法1）原理及依据病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争2）操作程序外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。茎尖培养1）茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低）2）培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。3）前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。4）培养条件：同一般茎尖培养5）外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取优缺点：茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。2、愈伤组织培养脱毒法（1）原理及依据a、病毒在植物体内分布不均匀b、病毒复制的能力衰退或丢失c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异（2）技术关键诱导再生植株的愈伤组织（3）操作程序植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些变异。（3）珠心组织培养脱毒法病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。缺点：会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。3.微体嫁接离体培养脱毒法应用微体嫁接的原因：木本植物茎尖培养难以生根形成植株。具体做法：将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关微体嫁接法(micrografting)脱除病毒的关键：①要求剥离技术很高②需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求；③与接穗的取材季节有密切关系（苹果4~6月取材嫁接成活率较高。）四、植物脱毒苗的鉴定1、视觉观察法(直接检测法)看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。番茄无菌小苗厚叶莲花掌植物病毒的症状植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种：（1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。（2）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑‘条纹等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。（3）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。（4）萎蔫：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水不足所出现的凋萎现象。2、生物鉴定法(指示植物indicatingPlant法)由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法,利用嫁接法接种，把待测的植物接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒。指示植物接穗嫁接后的植物指示植物indicatingPlant法定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法.优点:方法简单\灵敏\准确\擦方便,仍为一种经济有效的方法缺点:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出相对的感染力3、电子显微镜鉴定法小于0.1mm的病毒颗粒用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有的病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状和结构。较为先进的方法，但需一定的设备和技术4、抗血清鉴定法利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。特点:特异性高\测定速度快很常用抗血清的基本原理是通过植物病毒的抗原与抗体的专化结合,形成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性,受体植物无论显、隐症,无论是何种传播介质,均可通过抗血清反应法准确判断病毒的存在与否,进行病毒的快速诊断。五、无病毒种苗的保存、应用及繁殖（一）无病毒原种的保存获得无毒原种不易，若保存不好会很快重新感染病毒。为防止再度感染，应在隔离条件下保存。若原种保存得好，无毒原种可以利用5-10年，在生产上可以创造更多的经济效益。1、隔离种植保存通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。植物病毒的传播媒介主要是昆虫如蚜虫、叶蝉2、离体保存脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。（二）无毒原种的应用获得无毒原种后，一方面要积极进行无毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁育。无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能取得良好的效果；在老病区使用时应实行统一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效果。（三）无病毒原种的繁殖可在无毒源和其他病虫害的大田中进行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫、线虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原种繁育制度和栽培管理制度，防止病毒的再次感染。◆离体繁殖的使用范围1.用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等。用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等本章小结(1)去除植物病毒的方法有热处理法、微茎尖培养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。前两种是主要方法。(2)热处理法:为温汤浸渍处理法和热处理法。其中后者因不损伤植物材料，因而是目前最为常用的方法。(3)病毒主要分布于植物体成熟和衰老的组织及器官中，靠维管束传播。由于茎尖尚未形成维管束，所以茎尖一般是无毒的，可用于组织培养无毒苗。(4)无毒苗的鉴定方法主要有：①指示植物鉴定法；②抗血清鉴定法；③电子显微镜检查法；④酶联免疫鉴定法。其中，最后-种是目前比较精确和常用的鉴定方法。