质谱与SPE

行与维护篇－3为什么质谱使用一段时间后要进行质量数校正(欢迎补充)上一篇/下一篇2009-01-1616:44:25查看(516)/评论(23)/评分(16/0)质谱分析是利用电场或磁场将运动的离子按它们的质荷比大小分离后进行再进行检测的一种分析方法（TOFMS是个例外），该检测过程是通过控制质量分离器上的电压或频率使得一定m/z的离子通过（质谱图中的x轴），检测器再给出该离子的信号强度（y轴），离子的分离过程和检测过程可视为按照先后顺序进行的两个过程。质谱仪实际上给出的是质量分析器的电信号（x轴）和检测器的电信号（y轴）之间的对应关系，通过软件处理后便成了我们看到的质谱图。因此，任何影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系的因素均会影响质谱的质量准确度和灵敏度。下面我们可以分开探讨各因素的影响：（1）仪器污染引起的质量数偏移：质谱仪经长时间使用后在质量分析器表面难免会附着一层污染物，当初仪器质量数校正时的电参数的有效性会发生变化。这种变化可能并非仪器给出的电压的发生偏移，而是仪器给出的电压由于污染物的存在导致有效电压偏离（表观电压发生变化），也就是有效电压与当初仪器质量数校正时的有效电压之间的差异，这种差异会影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系，导致质量数出现偏移，当然也会因离子通过率的差异对仪器的灵敏度也有一定影响，但主要对前者影响更为显著。因此，仪器使用一段时间后需要进行质量数校正，理论上校正周期应与仪器污染程度相关，但我们看不到仪器也不好直接测定仪器的污染程度。笼统地说，校正周期与仪器的使用情况有关，这种情况导致的质量数飘移的校正通常是使用外标法进行。检测器污染也会导致仪器的灵敏度降低，有些情况下需要通过调整电子倍增器的电压。（2）温度和湿度对电子元器件的性能的影响：对于常规仪器而言温度和湿度对电子元器件的性能可以忽略，但对于非常规电压、高频率或电压高频切换的设备而言，温度和湿度对电子元器件性能的影响不可忽略。一个电阻由于温度或湿度的影响其阻值会发生变化，当然也会影响质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系。如由于温度的变化导致的电子元器件的性能差异足可以使得一台仪器质量数偏移0.1-0.3Da，当然各家的仪器或不同种类的仪器的温度或湿度敏感性存在差异，实际上每台仪器均对环境温度和湿度有所要求，这方面的影响因素不是很严重。（3）电源的影响：质谱仪是一次一次的扫描，一次一次地记录质量分析器的电信号和检测器电信号之间的对应关系。我们的动力电源的电压理论上是介于＋/-220V之间的一个正弦波，实际上电压可能在某一瞬间会出现超过220V的“毛刺”，因此，我们很少直接将的仪器连到动力电源上，质谱仪需要配置净化电源，将瞬间会出现超过220V的“毛刺”滤掉（断路器是另外一会事，是防止停电后在没关仪器时突然来电造成的对仪器的冲击），即使这样不能完全保证我们的质谱仪器重复扫描时质量分析器的电信号和检测器电信号之间完全对应。因此有时候我们在进行质谱分析时需要在样品中加入分子量标准品的内标进行质量数校正（当然不完全是电源的影响，也包括仪器其他性能指标的影响）。（4）真空度不足导致的影响：质谱仪的真空度是影响离子运动速率的重要因素，真空度不足容易导致离子与气体分子碰撞从而降低离子的运动速率，对质量分析器的电信号和检测器电信号之间对应关系的影响主要是体现时间对应性等方面从而影响质量准确度，同时真空度不足导致的离子运动速率变化也会影响质谱的分辨率。当然，有些仪器的质量分析器（如离子阱）需要充一定量的氦气以减缓离子运动速率，但氦气的冲入量十分有限且不影响仪器的真空状态，这是另外一回事，对于离子阱质谱而言，氦气不足的情况下仪器很难达到正常的真空状态，仪器显示的真空度怎么也上不去。总之，仪器的真空状态很重要，在开机时仪器自检通过之后最好再抽上一段时间再进行样品分析，确保仪器的真空状态。希望这些探讨有助于zhufangwei提出的问题，探讨的内容倘有不妥之处，敬请各位大侠斧正，目的在于使我们对类似的问题通过讨论理解地更为透澈。在此祝各位从事分析的同仁春节愉快！1在通常情况下，RP-HPLC主要基于样品中不同组分的极性差异进行分离，一般用于非极性或弱极性化合物的分离，但这种解释不适用于分子量较高的物质分离（如蛋白质样品等,但不包括蛋白质酶解后的多肽样品）。2普通C18色谱柱的填料尺寸是~5m，孔径是150埃，是市场上最常见、使用最为广泛的色谱柱。但是普通C18柱一般不用于分离蛋白质样品，原因是蛋白质容易造成柱阻塞，这也是使用普通色谱柱分离蛋白质样品后柱压升高的主要原因之一；分离蛋白或高分子量多肽样品一般使用填料尺寸是~5m，孔径是300埃色谱柱。3因此，对于低分子量组分RP-HPLC主要基于不同组分极性的差异进行分离，而普通C18色谱柱分离分子量较高的组分时，分子筛效应会影响其在色谱柱中的保留行为，而不仅是基于不同组分的极性差异。当分子尺寸超过“某一范围”时在整体上出现这样的结果：分子量相同的物质极性越小保留时间越长，极性相同的物质分子量越大其保留时间越长。分子筛效应与目标物的分子量、形状有关。所说的“某一范围”并不好界定，对于高聚物和蛋白，这个“某一范围”肯定有区别。4对于从血浆中萃取出的样品或微生物/细胞浸提后的溶液，待分析的目标物可能是分子量较低的物质，但是萃取过程肯定会将部分多肽、脂类或微生物代谢产物等分子量较高的物质与目标物同时提取出，N2气吹干只是起到了浓缩或便于后续定容等效果，但多肽或脂类仍然留在样品中。导致HPLC/MS分析过程中，目标物被顺利洗脱出，但随后其它高分子量杂质也逐渐被洗脱出且杂质的分子量随保留时间延长逐渐上升，导致基线逐渐向上飘移。5所以，yf197854提出的问题原因之一是有许多其它杂质被萃取出，改变萃取条件使杂质等尽量地少浸提出可能会降低基线漂移，或优化色谱条件使得杂质尽量晚出来，这方面aa_tang先生的帖子中已经总结的很好、很全面，这里不再重复了。另一方面是象Hongyi先生提出的改变质谱监测模式－调整扫描范围或离子扫描方式，使质谱不检测超出设定分子量范围的杂质，基线就不会漂移特别严重，得到的总离子流图相对比较漂亮。6对于天然产物提取物、中药中的动物药等任何含有蛋白质和高分子量多肽的样品，上述情况也较为常见。欢迎大家一起讨论上述内容，同时也帮助yf197854同志解决一个实际问题。用了氨水调PH会影响正离子模式下的相应强度（1）在质谱分析过程中，氨水、三乙胺和三甲胺属于质子受体（后两者最好不要使用）；酸（如甲酸、乙酸等）属于质子供体，（避免使用盐酸和硫酸等无机酸）。（2）碱性化合物的质谱分析一般采用正离子模式，流动相的pH一般低于目标物的pKa2－3个单位，用甲酸、乙酸和TFA等调节pH；TFA还可以改善色谱分离度，减少拖尾，但主要是针对硅胶基质的色谱柱；对于有机物高分子基质的色谱柱的改善不明现，因此，液质联用分析时最好使用甲酸或乙酸。（3）酸性化合物的质谱分析一般采用负离子模式，流动相的pH一般高于目标物的pKa2－3个单位，用氨水、三乙胺和三甲胺等调节pH；注：普通分析纯的三乙胺和三甲胺不干净，流动相中加入三乙胺和三甲胺后质谱图中会出现大量聚合单元为136和168的聚合物，且响应很高，所以能使用氨水就不要使用三乙胺和三甲胺。因此，用了氨水调PH会影响正离子模式下的信号强度，但影响程度与目标物的性质有关系；在流动相中添加了氨水后，对有些非常容易离子化的化合物的正离子信号影响不显著，但有些化合物质谱信号强度会被大幅度降低。一点拙见、敬请参考！！前的帖子－质谱使用经验小结上一篇/下一篇2008-11-0511:28:28查看(57)/评论(4)/评分(5/0)0做样前－检查氮气，流动相，质谱仪的真空度，毛细管温度，…1最好不用直接进样（容易污染离子源）！2做联用时最好分流（a可以使用常规柱，b缩短分析时间，c延长质量分析器寿命）3最好使用在线切换阀，降前每个样品的前后1－2分钟的流动相切入废液（避免样品中的盐进入质谱，做Sequence时可以把平衡柱子的流动相切入废液）4开始联用前，直接运行质谱数分钟，可以先将温度（毛细管温度和离子源温度（APCI））加热到预设定值（如果是APCI源还可以避免将烧掉heater，很贵的，我烧掉过一个）5待机时将切换阀置于waste，避免刚开液相时将流动相打入离子源，6关机前毛细管的温度先降下来，稳定一段时间后再关闭电源，避免风扇停止转动后毛细管外围的热量向里扩散，容易引起内部线路及电子元器件老化加速，7每天清理毛细管口外部，擦洗干净，每次停机时注意清洗Skimmer，用无尘擦拭纸，kimberly那种，8如果用的是钢瓶而且天天做样的话，将两个钢瓶并联，当然，一月不做一次的话就算了，9做定量时注意离子源喷针的具体位置，否则标准曲线就不能用了，10不要不经过柱子分离进行定量分析，结果不可靠（竞争性抑制目标分子离子化）11如果是负离子检测的话，可以相流动相中加入少量异丙醇，12不好使用不挥发性盐，可以使用挥发性盐，但浓度不要超过20mmol/l13需要使用酸的情况下可以用甲酸，乙酸，三氟乙酸可以用，但能用甲酸或乙酸时就别用TFA运行与维护篇－2ThermoIontrapMS开关机程序及注意事项上一篇/下一篇2008-11-2211:32:04查看(170)/评论(13)/评分(14/0)前些时间做过一些仪器的使用培训，就大家关注的开关机程序总结如下，不知是否有不妥之处，欢迎批评指正并加强沟通与交流。1开机前准备事项(1)确保质谱仪的主电源开关及主板电源开关均处于关闭状态；(2)检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间；(3)查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液（有积液易导致heater烧毁）；(4)气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至规定压力，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至规定压力；（仪器关闭状态下也不建议关闭气体钢瓶）(5)检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口；(6)确保室内温度在18～25度。；(7)开启动力电源（不是质谱仪的主电源），电压稳定，正常；2质谱主机开机操作规程（1）打开计算机，系统启动完成后进行操作步骤（2）；（2）打开质谱主电源开关，白色电源开关处于位置（I），机械真空泵开始工作；（3）机械真空泵工作3－4小时后开启主板电源（黑色电源开关处于位置（I））；机器关闭时间越长，则重新开机时机械真空泵预工作时间越长；（4）主板电源开启3-5min后质谱仪开始启动自检系统，计算机在Dos界面下运行InstrumentConsole命令，质谱仪开始自检，检测各参数是否正常，并在DOS界面下显示参数检测记录；（5）检测仪器在InstrumentConsole界面下各参数检测结果；（6）当出现VacuumisOK，则真空系统正常，如果出现VacuumisnotOK，则需要继续延长系统预工作时间；（7）在计算机桌面上双击图标打开TunePlus软件，在其界面上点击IonGauge，出现如下界面；当系统真空度达到预定值时，IonGauge处于On状态，否则，需要继续延长系统预工作时间，手动点击On前的按钮，观察IonGaugePressure和ConvectronGaugePressure的真空度（8）检查仪器的IonGaugePressure和ConvectronGaugePressure真空度是否达到预定值。（9）开机完成。3质谱关机程序（1）断开液相与离子源之间的连接管路，确保离子源内没有积液；（2）将DivertValve阀位置切换至Waste，确保液相的流动相导入废液；（3）打开方法Standby.LCQTune，将加热毛细管的温度降至200度以下，以减少关机后毛细管外部热量向仪器内部扩散，减缓仪器内部线路及电子器件的老化；（4）在TunePlus界面关闭IonGauge，在菜单Control下点击命令Off；（5）关闭Tune