肿瘤标志物的检测及临床应用

肿瘤标志物的检测及临床应用金堂县第一人民医院检验科喻茂文2016.4.8肿瘤发病率和死亡率WHO：全世界每年肿瘤死亡人数为630万。1997年全国肿瘤防治研究所办公室的统计资料：我国恶性肿瘤的死亡率为108.39/10万，占死亡人数的17.94%，居死亡原因的第二位。肿瘤免疫学(tumorimmunology)是研究肿瘤抗原性质、机体对肿瘤的免疫应答、机体免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤免疫学诊断和免疫学防治的科学。肿瘤抗原肿瘤抗原（tumorantigen）是指在肿瘤发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原物质。机体产生肿瘤抗原的可能机制为：①基因突变。②细胞癌变过程使原本不表达的某些基因被激活。③抗原合成过程的某些环节发生异常如糖基化异常。④胚胎时期抗原或分化抗原的异常、异位表达。⑤某些基因产物尤其是信号转导分子的过度表达。⑥外源性基因（如病毒基因）的表达。根据肿瘤抗原的特异性分类1．肿瘤特异性抗原（tumorspecificantigen,TSA）是肿瘤细胞所特有的新抗原，它只表达于肿瘤细胞，而不存在于正常组织细胞。2．肿瘤相关性抗原(tumorassociatedantigen,TAA)是指非肿瘤细胞所特有的，正常组织或细胞也可表达的抗原物质，但此类抗原在癌变细胞的表达水平远远超过正常细胞。根据肿瘤抗原产生机制分类1．理化因素诱发的肿瘤抗原2．病毒诱生的肿瘤抗原3．自发性肿瘤抗原4．正常细胞成分的异常表达⑴分化抗原⑵过度表达的抗原⑶胚胎抗原⑷细胞突变产生的独特型抗原机体抗肿瘤的免疫学效应机制机体抗肿瘤的免疫学效应十分复杂，涉及特异性和非特异性抗肿瘤机制相互交错，体液免疫与细胞免疫机制相互协调和补充，从而共同执行免疫监视功能。一、抗肿瘤的细胞免疫机制㈠T细胞1.CD4+T细胞2.CD8+T细胞(在抗肿瘤效应中起关键作用)3.γδ+T细胞㈡NK细胞㈢巨噬细胞二、抗肿瘤的体液免疫机制1．补体的溶细胞效应2．抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应3．抗体的免疫调理作用4．抗体封闭肿瘤细胞表面某些受体5．抗体干扰肿瘤细胞粘附作用6．其他机制肿瘤免疫学检验肿瘤免疫学检验是指用免疫学的方法检测肿瘤抗原、抗体等肿瘤标志物和肿瘤患者的免疫功能状态，为肿瘤的诊断、观察病情、评价疗效及预后具有重要价值。肿瘤的早期诊断虽有可能(因为肿瘤潜伏期可长达数月至数年)，但实际上十分困难，因为目前大多数的诊断技术都不适合肿瘤的早期诊断。用生物物理方法，如X线，CT和超声等检查，只有当肿瘤大小至少到1～2cm时才能发现，而此时肿瘤细胞数已达109以上。用免疫学方法检测，肿瘤细胞需达到106才可检出，但此时可能已经发生肿瘤转移，而且并不是所有肿瘤在此时都能被检出。长期以来人们致力于寻找一种能够尽早检出恶性肿瘤的指标，并将已经发现的一些物质称之为肿瘤标志物（TumorMarker,TM）。一、肿瘤标志物近年来随着现代科技的不断发展，免疫学，分子生物学，细胞生物学，生物化学的深入研究，发现了许多特异性较强，有一定临床价值的肿瘤标志物100多种，受到国内外学者的高度重视。1.肿瘤标志物的定义肿瘤标志物（tumormarker，TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等。患者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有一定的价值。理想的肿瘤标志物应具有：⑴特异性100%⑵灵敏度100%⑶器官特异性⑷与肿瘤的大小或分期有关⑸与预后有关至今尚无任何肿瘤标志物能满足所有上述标准2.肿瘤标志物的分类体液肿瘤标志物的分类和命名尚未完全统一，一般分为：⑴胚胎抗原类：如AFP，CEA等。⑵糖链抗原类：如CA125，CA15-3，CA19-9等。⑶激素类：如患甲状腺髓样癌时降钙素升高，患绒毛膜细胞癌时hCG明显升高。⑷酶和同工酶类：γGT，PAP等。⑸蛋白质类：β2微球蛋白，铁蛋白，本周蛋白等。⑹癌基因产物类如ras基因蛋白，myc基因蛋白，p53抑癌基因蛋白等。3.影响血液和体液中肿瘤标志物浓度的因素⑴肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目。⑵肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度。⑶肿瘤组织的血液供应好坏。⑷肿瘤细胞是否有坏死和坏死的程度。⑸肿瘤细胞的分化程度和肿瘤的分期。⑹肿瘤细胞是否表达和合成肿瘤标志物。⑺肿瘤标志物在体内的降解和排泄速度。肿瘤标志物的临床应用正常人群中的筛查有症状者的辅助诊断癌症的临床阶段的分期疾病进程的预后指标评估治疗方案判断癌症是否复发治疗应答的监测肿瘤标志物用于普查的五项原则应十分清楚该肿瘤的发病率应能检测早期肿瘤该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好普查所需费用能被接受定位TM基本上不能对肿瘤定位极少数TM如PSA,甲状腺球白等具器官特异性，但不是肿瘤特异性。确诊通常不能进行确诊因为TM无足够的灵敏度，不能排除假阴性结果。但本周蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP(肝癌)、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（C-细胞癌）等有助确诊。分期大多数TM与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以TM浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的TM浓度范围极广，且互相重叠。预后术前TM浓度增加，术后降低，表示这些TM对此肿瘤有预后价值。在病程监测中，TM的浓度增加或降低与疾病的预后密切相关。TM评价治疗有效性方案（Beastall,1991)无效：TM浓度与治疗前相比下降50%改善：TM浓度与治疗前相比下降50%有效：TM浓度与治疗前相比下降90%预测敏感性•阳性结果在肿瘤患者中的比例敏感性＝特异性•非癌症患者个体中(如健康人或良性疾病患者),阴性实验结果的比例特异性＝真阳性结果数患病人群总数真阴性结果数对照组人群总数实验结果的期望值期望值：阳性期望值(PV+)：在阳性结果的病人中，癌症存在的可能性PV＋＝阴性期望值(PV－)：在阴性结果病人中,非癌症存在的可能性PV－＝临界值：把健康人和癌症病人分开的TM的浓度真阳性结果数阳性结果总数真阴性结果数阴性结果总数参考值与临界值对TM而言，以参考值表示基本无意义，应以临界值来表示。TM在实际应用中注重的是最佳临界值，即区分“正常”与否的分界线。它不同与参考值，因为参考值来自一组对照人群，而临界值是根据金标准确诊为病人和对照两组人群所确定的。金标准“金标准”主要指活体组织检查、病原学检查、细胞学检查、特殊影像诊断、长期随访及临床医学专家共同制订的公认的综合诊断标准。敏感性和特异性常常是一对矛盾，提高了敏感性，降低了特异性，即提高了肿瘤的检出率，同时提高了肿瘤的假阳性率；反之，提高了特异性，降低了敏感性，即提高了肿瘤诊断的准确性，同时降低了肿瘤的检出率(漏诊)。临界值临界值由三方面决定根据金标准确定病人和对照两组例数相似的人群，并测出各组的实验数据。用该实验数据的不同域值区分阳性和阴性的不同分界点，分别计算灵敏度和特异性。绘制ROC曲线，最接近左上角的点即为最佳临界值，其灵敏度最高，特异性最强。ROC曲线受试者工作特征曲线(ROC曲线)ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。ROC曲线真阳性率为纵坐标,假阳性率为横坐标,在座标上由无数个临界值求出的无数对真阳性率和假阳性率作图构成。临界值应根据需要确定选择临界值不能同时提高灵敏度和特异性。将临界值提高，特异性增加但灵敏度降低。将临界值降低，灵敏度提高但特异性下降。体检时应选择较高的灵敏度，将有问题的人尽量多地检出；确诊时应选择较高的特异性，以减少假阳性结果。肿瘤标志物的检测方法标记免疫学的基本原理示踪物的标记技术+免疫学技术根据示踪剂的不同可分为化学发光免疫分析酶免疫分析荧光免疫分析放射免疫分析金标记免疫分析肿瘤标志物的检测最好能做定量测定临床免疫检测的选择当然是灵敏度更高，同时特异性更高的方法（化学发光及电化学发光）！二、常见肿瘤标志物1.胚胎抗原类肿瘤标志物⑴甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）AFP是胎儿发育早期合成的一种糖蛋白(α1球蛋白)，分子量70kD(生物大分子分子质量单位)，胎儿出生后不久即逐渐消失。参考值：血清AFP20μg/L。①原发性肝癌，77%的患者AFP300μg/L，但有部分患者AFP始终不升高。②病毒性肝炎与肝硬化患者，血清中AFP可有不同程度的增高，但一般在300μg/L以下。③生殖系统肿瘤和胚胎性肿瘤，如睾丸癌、畸胎瘤等升高。④妊娠三个月后，血清AFP含量开始升高，分娩后三周恢复正常。若孕妇血清中AFP异常升高，应考虑有胎儿神经管缺损畸形的可能性。⑵癌胚抗原（CEA）1965年CEA发现于成人结肠癌组织中，分子量约为200kD，可溶性糖蛋白，主要存在于成人癌组织以及胎儿的胃肠管组织中，故名癌胚抗原，是一种广谱肿瘤标志物。参考值：血清CEA5.0μg/L①结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，转移性恶性肿瘤也有不同程度的阳性率；在恶性肿瘤的随访，病情监测，疗效评价等方面有重要价值。②肠道息肉、憩室炎、结肠炎、肝硬化、肝炎、胰腺炎和肺部疾病也可有不同程度的升高。③吸烟者中约有33%的人CEA＞5μg/L。CEA的浓度与癌症的早、中、晚期有关，越到晚期CEA值越高。2.糖链抗原类肿瘤标志物（1）糖链抗原15-3(CA15-3)CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，属糖蛋白，分子量超过400kD，可用一对单克隆抗体（MAb115D8和MAbDF3）进行双抗体夹心法来识别。与CA15-3同类的多态性上皮粘蛋白抗原还有MCA，CA27-29，CA549等。参考值：血清CA15-328kU/L。①乳腺癌，但在乳腺癌的早期阳性率较低约为30%，转移性乳腺癌阳性率可达80%。②其他恶性肿瘤，如肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，原发性肝癌等，也有不同程度的阳性率。③肝脏，胃肠道，肺，乳腺，卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率一般低于10%。乳癌初期敏感性约为60%，晚期可达80%。（2）糖链抗原125(CA125)CA125是很重要的卵巢癌相关抗原，1981年Bast发现。CA125是一种大分子多聚糖蛋白。参考值：血清CA12535kU/L。①卵巢癌，阳性率约为61.4%。手术和化疗有效者CA125水平很快下降，若有复发，CA125升高可先于临床症状出现之前。②其他恶性肿瘤，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，结肠直肠癌34.2%，其他妇科肿瘤43%。③非恶性肿瘤，如子宫内膜异位症，盆腔炎，卵巢囊肿，胰腺炎，肝炎，肝硬化等疾病也有不同程度升高。④妊娠早期，CA125有升高。（3）糖链抗原19-9(CA19-9)CA19-9是一种与胰腺癌，胆囊癌，结肠癌和胃癌相关的肿瘤标志物，又称胃肠癌相关抗原。参考值：血清CA19937kU/L。①胰腺癌，胆囊癌，胆管壶腹癌时，血清CA19-9水平明显升高，阳性率约为74.9%，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA19-9浓度可达40万kU/L，是重要的辅助诊断指标。②胃癌，阳性率约为50%，结肠癌，阳性率约为60%。③急性胰腺炎，胆囊炎，胆汁淤积性胆管炎，肝硬化，肝炎等疾病，CA19-9也有不同程度的升高，注意与恶性肿瘤的鉴别。3.酶类肿瘤标志物⑴前列腺特异性抗原(PSA)PSA是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶。在血清中PSA以两种生化形式存在：一部分(5%～40%)是以低分子量(33kD)的游离PSA（f-PSA）形式存在。大部分(60%～90%)是以PSA和α1–抗糜蛋白酶、α2-巨球蛋白等结合的形式存在，称复合PSA(c-PSA)。总PSA（t-PSA）,包括血清中f-PSA和c-PSA。血清PSA升高①前列腺癌患者升高，但大约25%患者，其PSA水平正常；而大约有50%的良性前列腺疾病患者PSA水平增高。为增加PSA对前列腺癌检测的