N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列

第23卷第6期2011年6月Vol.23,No.6Jun.,2011生命科学ChineseBulletinofLifeSciences文章编号：1004-0374(2011)06-0605-07N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列周　蕾，顾建新*(复旦大学上海医学院，卫生部糖复合物重点实验室，上海200032)摘　要：蛋白质的N-糖基化修饰是生物体调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性的一种普遍的翻译后方式。N-糖基化位点是理解糖链功能的重要前提之一。应用新的糖蛋白、糖肽富集技术和质谱技术，科学家们在不同组织中完成了对N-糖基化位点的鉴定。此外，不同于经典三联子的N-糖基化序列的发现使人们对N-糖基化过程的认识向纵深发展。关键词：N-糖基化；糖基化位点；非经典序列中图分类号：Q513.3文献标志码：AN-glycosylationsitesanalysisandnonconsensusN-glycosylatedsequencesZHOULei,GUJian-Xin*(KeyLaboratoryofGlycoconjugateResearch,MinistryofHealth;ShanghaiMedicalCollege,Fudanuniversity,Shanghai200032,China)Abstract:N-glycosylationofproteinsisthemostcommonpost-tranlationalmodification,stronglyinfluencingmanyoftheirlocation,function,activity,lifespananddiversity.OurknowledgetoN-glycosylationsitesisoneofthemostimportantprerequisitesfordetailedfunctionalunderstanding.Usingnewmethodsbasedonglycoproteins/glycopeptidesenrichmentandmassspectrumtechniques,scientistshavebeenabletoidentifyglycosylatedsitesindifferenttissues.Besides,thediscoveryofnovelsequencepatternsforN-glycosylationwillhelptounderstandtheprocessofN-glycosylationbetterinfuture.Keywords:N-glycosylation;glycosylationsites;nonconsensussequences收稿日期：2011-02-28基金项目：国家自然科学基金项目(30930025，31010103906)*通信作者：E-mail:[e-mail]糖基化(Glycosylation)是指蛋白质或脂质在酶的作用下被连接上糖链的过程。作为生物体内最为重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，糖基化调控了蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性[1-2]。细胞内超过50%的蛋白质都修饰有糖链，它们参与了包括细胞识别、细胞分化、发育、信号转导、免疫应答等在内的各种重要的生命活动。在多种疾病，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管病、代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展中均伴随着蛋白质糖基化异常的发生[3-4]。因此，针对糖链形成、糖链结构和糖链功能的糖生物学研究已成为当前生命科学不可忽视的领域。区别于非酶糖化(Glycation)过程，糖基化过程中糖链的连接需要在糖基转移酶的作用下完成，同时还具有位点特异的性质。根据结合位点和结构的差异，糖链分为以下几种类型：(1)连接于天冬酰胺(Asparagine,Asn)残基酰胺氮的N-连接糖链；(2)连接于丝氨酸(Serine,Ser)、苏氨酸(Threonine,Thr)残基羟基氧的O-连接糖链；(3)与磷酸丝氨酸上的磷酸连接的糖链；(4)连接于色氨酸(Tryptophan,Trp)残基上碳的C-连接糖链(很少见)；(5)糖基磷脂酰肌醇化。其中，N-连接糖链(或称N-糖基化)在真核生物中广为存在，也是研究最为深入的一种糖基化方式。早在二十世纪六七十年代，N-连接糖链的生生命科学第23卷606物合成过程就被阐明，这一过程在内质网中进行，最初是将一个14糖的脂连接前体寡糖添加到新生肽链的天冬酰胺上。在真核细胞中，启动N-连接糖链合成的供体结构几乎是一致的，包括3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰氨基葡萄糖分子(Glac3Man9GlcNAc2)，而由于高尔基体中糖苷酶和糖基转移酶的作用，最终可以产生高甘露糖型、复合型和杂合型三个主要类别的N-连接糖链。这些糖苷酶和糖基转移酶有限定的专一性，要求它们在规定的顺序下发挥作用。而特定糖蛋白上出现的糖链结构，主要取决于合成该糖蛋白细胞中所表达的糖基转移酶。早期对N-糖基化修饰肽链的研究表明，接纳体天冬酰胺周围所需的最小序列是Asn-X-Thr/Ser，这里X是除了脯氨酸(Proline,Pro)之外的任何氨基酸。不同于核酸和蛋白质，糖链的生物合成具有非模板性和结构的微观不均一性，一种给定的糖蛋白可以连接有多种不同的糖链形式而形成多种糖形。这一性质使糖蛋白具有了更多的分支结构、连接方式和空间构象，携带了更多的生物信息，行使着更为复杂的功能；然而，这种特性也给糖蛋白的分离和分析带来了重重困难。近年来，随着各种技术的兴起和发展，尤其是分离纯化技术、质谱技术、生物芯片技术的推进，糖链的富集和鉴定方法日趋成熟，针对糖基化位点、糖链结构开展各项研究成为可能。1　N-糖基化位点分析方法尽管N-糖基化修饰有着重要的生物学功能和临床意义，我们当前对生物体内N-糖链信息却还知之甚少。建立糖链结构和功能间的联系(功能糖组学)，检测疾病诊断和预后相关的糖基化变化，阐明病原微生物感染过程的机制是当今糖生物学研究的热点问题[5-7]。总的来说，对糖基化的分析可以从以下几个方面来考量：(1)研究整体糖蛋白的糖链；(2)研究糖肽；(3)研究化学方法或酶法释放的糖链结构(图1)[8]。此外，在选择进行糖基化分析的方法之前，还需要考虑以下一些因素：(1)所需的信息量；(2)优先考虑的是数据的质量还是数量；(3)有多少样品量可以提供[8]。在N-糖基化相关的信息中，发生N-糖基化的位点是我们理解其糖链功能的基础。除了传统生物化学中应用点突变等方法对糖基化位点进行研究，生物质谱技术也在N-糖基化位点的鉴定中发挥了重要作用。传统糖蛋白鉴定方法中，研究者往往通过凝胶电泳将糖蛋白混合物分离开来，应用酶联糖链特异抗体或凝集素通过化学发光法或过碘酸反应(periodicacidSchiff,PAS)染色来检测。糖蛋白随后经由多步色谱柱纯化，再应用自动Edman测序来测定糖基化位点[9]。尽管生物质谱技术的应用提高了分析的效率，应用这种方法大部分糖蛋白还是需要进行逐一分析[10]。2006年，Kaji等[11]综合前人HPAec-PAD，含脉冲安培计的高效离子交换色谱；Mecc，毛细管胶束电动色谱；cIeF，毛细管等电聚焦；cZe，毛细管区带电泳；MALDI-MS，基质辅助激光解吸电离质谱；ce-lIF，激光诱发荧光毛细电泳；HILIC，亲水作用色谱；WAX，弱阴离子交换；rP，反相；eSI-MS/MS，电喷雾离子阱串联质谱；MALDI-toF，基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱；cID，碰撞诱导离解；etD，电子转移解离；ecD，电子获取解离。图1糖蛋白、糖肽和糖链研究的主要方法[8]周　蕾，等：N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列第6期607的方法，提出了应用于大规模糖蛋白位点鉴定的方法——IGOT(isotope-codedglycosylationsite-specifictagging)。如图2所示，该方法由以下步骤组成：(1)通过凝集素亲和层析，抓取蛋白酶水解后的糖肽；(2)通过疏水亲和层析纯化蛋白酶水解后的糖肽；(3)N-糖苷酶介导的糖基化位点的18O掺入；(4)通过液相色谱与质谱耦联的蛋白质组学技术，鉴定被18O标记的肽段。应用这一方法，研究人员检测了秀丽隐杆线虫和小鼠肝脏的粗提取物，在一周时间内就可以检测到数百至几千种糖蛋白，并获得其糖基化位点[12]。随后的研究也陆续从组学的角度从不同组织中发现了数百种糖基化位点，例如，2009年Wollscheid等[13]检测了免疫系统中细胞表面的糖蛋白N-糖基化位点；Gundry等[14]检测了鼠胚胎成纤维细胞中的糖蛋白的N-糖基化位点；人血浆、血清和唾液腺中糖蛋白的N-糖基化位点也都被检测[15-16]。2010年，Zielinska等[17]根据前人建立的“过滤辅助样品制备(FASP)”方法[18]发展了新的糖肽富集方法，可以更为高效地捕集包括膜蛋白在内的糖蛋白(图3)。研究人员应用这一方法分析了鼠的4种组织和血浆，发现了2352种糖蛋白上的6367个N-糖基化位点，这是迄今为止，对N-糖基化位点的分析中数据量最大的。2　N-糖基化位点研究2.1　经典N-糖基化位点研究前人对N-连接糖链的研究发现，在蛋白质的一级结构中，糖基化的天冬酰胺残基几乎固定不变地出现在三联子，即Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸[19-20]。寡糖基转移酶(OST)复合物和多萜醇结合前体聚糖供体的结构和性质解释了N-糖基化的发生对序列C端氨基酸残基的要求。对糖基化序列中Asn随后的+2位氨基酸的点突变研究表明氨基酸中氢受体(hydrogenacceptor)的存在对将多萜醇上的Glac3Man9GlcNAc2连接到Asn的亲核取代反应是必需的[21,22]。研究人员对N-糖基化基序进一步研究，将Asn+2位氨基酸置换为Thr类似物。结果表明，OST复合物既不能容忍+2位上Thr甲基基团的改图2通过IGOT-LC-MS/MS大规模鉴定N-糖基化位点的方法[11]根据FASP操作方法处理全组织SDS-裂解液(a,b);在过滤设备单元中加入可溶的凝集素富集糖肽(c);经离心去除未与凝集素结合的肽，同时用糖苷酶水解结合的肽(d);从过滤装置上洗脱(e)。图3样品制备和N-糖基化肽段富集(N-Glyco-FASP)，标准30K过滤设备作为反应环境[17]生命科学第23卷608变，也不能容忍电荷的参入[23-24]。Asn+2位上如果是Thr，那么该序列发生N-糖基化的概率会更大[25-26]。此外，+1位上的氨基酸不是Pro也是N-糖基化发生的必要条件，这是由于Pro的环形结构会造成肽链骨架的刚性增加造成的[27]。研究发现，在OST的作用下，三联子序列的二级结构会发生改变，+1位的氨基酸的位置会远离Asn侧链氨基复合物和+2位Ser/Thr侧链的羟基。当三联子序列N端或C端存在半胱氨酸(Cysteine,Cys)时，由于二硫键的形成，使得构象的刚性增加，从而使N-糖链发生的概率降低[28]。近年来，研究人员针对蛋白质数据库中已经确定发生N-糖基化修饰的Asn附近的氨基酸展开了研究，结果发现，Asn紧邻的前一位氨基酸是芳香族氨基酸或疏水氨基酸的可能性较大，而+1位和+3位分别是小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸的可能性较大。除了+1位完全没有和+3位可能性较小之外，Asn的邻近序列中常会发现Pro的存在。从结构的角度来看，连有糖链的Asn多出现在肽链转角或弯曲处[26,29]；进一步的研究发现，N-糖基化修饰发生与否，往往依赖于Asn侧链和+2位Ser/Thr侧链的羟基间的距离，两者相距约0.73Å时，最有可能在Asn上连接上糖链[30]。尽管二级结构是考量三联子序列中Asn是否会发生N-糖基化的的因素，但值得注意的是，在修饰发生的时候，蛋白质的结构尚未形成。在粗面内质网腔中，OST复合物会