-化学发光分析法

2020/3/3第十六章分子发光分析法一、基本原理principle二、化学发光分析的特点characteristics三装置与技术instrumentandtechnology第三节化学发光分析法molecularluminescenceanalysischemiluminescenceanalysis2020/3/3一、基本原理principle1.化学发光反应在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2020/3/32.化学发光效率化学效率：emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数参加反应分子数激发态分子数ce发光效率：激发态分子数产生光子数em时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：tctIddclcldc/dt分析物参加反应的速率；2020/3/33.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：cttcttIAttcl0cl0cldddddc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：2020/3/34.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应O3→O2+O（1000C石英管中进行）SO2+O+O→SO2*+O2SO2*→SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；2020/3/3O3→O2+O（1000C石英管中进行）NO+O→NO2*NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：CO+O→CO2*CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与NO的发光反应：2020/3/3c.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；2020/3/3（2）火焰中的化学发光反应在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮NO+H→HNO*HNO*→HNO+h发射光谱范围：660～770nm；最大发射波长：690nm；在富氢火焰中：NO2+2H→NO+H2O该反应十分迅速；2020/3/3b.硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*S2*→S2+h发射光谱范围：350～460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2020/3/3（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：2020/3/35.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样氨基酸+O2酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2020/3/3草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。2020/3/3生物发光分析应用1在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：AMP·LH2·E+O2[氧化荧光素]*+AMP+CO2+H2O[氧化荧光素]*氧化荧光素+h最大发射波长562nm；2020/3/3生物发光分析应用2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：NADH+FMA+H+NAD++FMNH2NADH脱氢酶FMNH2+RCHO+O2FMN+RCOOH+H2O+h黄素酶最大发射波长495nm；2020/3/3二、特点characteristics1.灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。2020/3/32020/3/32020/3/3三、装置与技术instrumentandtechnology装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；2020/3/3内容选择：第一节分子荧光和磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二节分子荧光和磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis第三节分子发光分析chemiluminescenceanalysis结束