大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定2

大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxidedismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。试剂和器材大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液（3；5v/v)、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL3个、500mL3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根。方法1．SOD提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)。2．除杂蛋白提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3．SOD酶的沉淀分离剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。4．粗酶液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。5．溶液中可溶性蛋白含量测定分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。试剂/（mL）空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2提取液稀释：50×粗酶液稀释：20×酶液稀释：10×实验结果提取液粗酶液酶液总体积（ml）提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280－0.74A260)×稀释倍数蛋白质浓度（mg/ml）对照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值数据处理1．酶活力单位提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.12．总活力提取液总活力U=活力单位×总体积粗酶液总活力=活力单位×总体积酶液总活力=活力单位×总体积3．比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度4．纯化倍数粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力5．回收率粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力实验结果误差分析1．研磨和离心大概还不够充分。2．由于测量仪器的精密度引起的误差。3．在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分，这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；4．在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另一个原因；