细菌实验诊断技术与质量控制

第六章细菌实验诊断技术与质量控制一、教学大纲要求1、掌握临床常见标本的细菌学检验程序和方法2、掌握细菌学检验的形态学检查方法3、掌握细菌的分离培养技术和方法4、掌握细菌代谢产物检测与鉴定技术5、掌握细菌检验的质量控制6、了解细菌感染的分子生物学检测技术、细菌感染免疫学检测、细菌毒素的检测、细菌自动化检测技术。二、教材内容精要（一）标本采集、处理与检测标本采集的基本原则：尽早采集、根据可疑的病原体，选择不同采集时机和标本种类、在抗生素应用前采集、遵守无菌操作、正确保存和运送。容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。1.血液标本正常人的血液是无菌的。当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症，应预测其体温上升期进行采血。一般在使用抗生素前采集2~3次；多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取；对于已使用抗生素而无法停止的患者，也应在下次用药前采取。在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。采血量成人一般5~10ml，婴幼儿1~2ml。采集的血液标本注入培养瓶中先进行增菌培养，培养基和血液标本量的比例应10：1，将血液中的各类杀（抑）菌物质充分稀释。需氧菌常用培养基有胰酪蛋白大豆胨肉汤和葡萄糖酚红肉汤等，常加入对氨基苯甲酸（PABA）50μg/ml中和磺胺类，青霉素酶2单位/ml破坏青霉素类，硫酸镁中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。加入0.03~0.05%的聚茴香磺酸钠（sodiumpolyanetholsulfonate,SPS）可抑制血清中的抗菌物质，并对氨基糖苷类和多肽类抗生素有灭活效果。并加入Ⅹ、Ⅴ因子等生长因子。培养瓶每天观察一次。如发现①培养瓶内液体浑浊；②血球层上面出现颗粒状的生长物，并且有自下而上的溶血；③有明显的凝块；④液体表面有菌膜，培养液清晰或浑浊等，表明有细菌生长。直接进行涂片染色初步报告。同时分别接种血平板、巧克力（色）平板，普通培养和5%CO235℃培养。也可直接进行体外药敏试验。无细菌生长迹象的培养瓶孵育至第7d，接种血平板、巧克力（色）平板，分别进行普通培养和5%CO2环境35℃孵育24h。为了提高检出的速度，在培养的第2~3d时应移种一次。有厌氧菌感染时，同时注入需氧瓶和厌氧瓶，厌氧培养基通常用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等；培养液中有刃天青，无氧时无色，有氧时呈红色。需氧瓶和厌氧瓶同时浑浊，或需氧瓶无生长而厌氧瓶液体浑浊，提示厌氧菌生长。分别接种血平板和厌氧血平板，置需氧和厌氧环境中，如果都只生长1种细菌，则为兼性厌氧菌；如果仅在厌氧环境中生长，可以直接报告“有厌氧菌检出”。若长期应用抗细胞壁类抗生素，应考虑细菌L型存在，将血液接种高渗培养基中，分别进行需氧、厌氧和5%CO2环境培养。每周移种2~3次于高渗固体培养基上，观察有无细菌L型菌落生长。2.呼吸道标本正常上呼吸道有正常菌群。下呼吸道正常情况下无细菌或仅有少量细菌侵入咽拭子直接涂片检查怀疑白喉的标本，应立即进行涂片革兰染色和异染颗粒染色。如发现有呈Y、V、T等排列的棒状杆菌，有异染颗粒时可报告“找到有异染颗粒的革兰阳性杆菌”。也可用特异性的荧光染色法检查A群溶血性链球菌和百日咳鲍特菌。培养检查接种血平板，观察细菌的生长情况。有无特别的菌落生长，如为上呼吸道的正常菌群，比例大致正常，则报告“未检出致病菌”；如果某一种菌群明显占多数或接近纯培养，应考虑该菌与疾病有关，鉴定后报告。呼吸道标本特殊菌的培养百日咳鲍特菌接种在鲍-金（Border-Gengou）平板；白喉棒状杆菌接种吕氏血清斜面或鸡蛋培养基，同时接种亚碲酸钾血平板；脑膜炎奈瑟菌带菌者的鼻咽拭子35℃保温运送，尽快接种在35℃预温的卵黄双抗平板上，置3~5%CO2环境中35℃孵育24h。流感嗜血杆菌用巧克力平板或选择性平板。化脓性A群链球菌的接种血平板，在接种原始区贴一张0.04U的杆菌肽纸片作为A群链球菌存在的指示。痰液标本，采集晨痰为好。观察标本的性状，选取脓血性的部分，如发现有颗粒、菌块及干酪样物，可能是放线菌或真菌感染。有异常恶臭，与厌氧菌有关。直接涂片染色检查发现，以柱状上皮细胞为主，有中性白细胞及细菌，则可根据形态和染色性直接报告，并且作为分离细菌时选择培养基的依据。如果以鳞状上皮细胞为主，很少发现白细胞，则为不合格标本。如有颗粒、菌块及干酪样物也应进行涂片检查，发现具有典型的真菌或放线菌样的菌落特点，可直接报告“找到真菌（放线菌）”。痰液标本在分离接种前一般进行前处理，方法有均质化和洗净法。痰液标本至少同时接种血平板、巧克力平板和EMB（或MacConkey平板）。3.尿液标本正常人的尿液是无菌的，女性月经期间容易污染，不宜采集。尿液的采集方法有：中段尿采集法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺法，膀胱穿刺法一般用于厌氧菌培养的标本采集或不能正确留取中段尿而需确定诊断的儿童。尿液标本检验采用定量培养的方法进行尿液菌落计数区别污染和病原菌。一般认为尿液中的菌落数105/ml为病原菌，104/ml为污染菌，105/ml104/ml为可疑需重新复查，重新复查后仍为同样结果，则应视为病原菌。会受到尿量、尿液在膀胱中停留的时间长短及使用利尿剂等影响。计数的方法有：平板涂布法、倾注培养法和标准接种环法。一般接种血平板和EMB（或MacConkey平板），或CLED平板。尿液细菌L型较为常见，可同时接种L型平板。尿液标本的快速检验用于尿液快速细菌检验的方法有硝酸盐还原法、氯化三苯四氮唑（TTC）还原法、尿中抗体包被细菌法和产色培养基法等。4.脑脊液标本正常人的脑脊液是无菌的。脑脊液标本的采集以无菌手续通过腰椎穿刺采集脑脊液3~5ml，应立即送检或床边接种。应在35℃保温运送。直接涂片检查由细菌引起的化脓性脑膜炎一般呈现混浊，在抗生素治疗后亦可不混浊。此外结核性脑膜炎、无菌性脑膜炎等也不混浊。可直接涂片革兰染色检查，不混浊的可3000r/min离心10~15min后取沉淀涂片染色检查。如发现革兰阴性、凹面相对的双球菌，位于中性白细胞内外，则可报告“找到革兰阴性双球菌，位于细胞内（外），疑似脑膜炎奈瑟菌”；有革兰阳性矛头状的双球菌，菌体周围有明显的荚膜，可报告“找到革兰阳性双球菌，疑似肺炎链球菌”。用肺炎链球菌全价抗血清进行荚膜肿胀试验，阳性者可报告“荚膜肿胀试验检出肺炎链球菌”；发现其他形态的细菌，可根据形态和染色性进行报告。涂片阳性的标本最好进行标本的直接药敏试验。应立即接种在35℃预保温的血平板和巧克力平板上,置5~10%CO2环境35℃培养18~24h。脑脊液标本一般经3d培养仍未见细菌生长，可报告“经3天培养无细菌生长”。脑脊液标本特殊病原菌的检验结核分枝杆菌将脑脊液4000r/min离心30min，取沉淀抗酸染色；或将脑脊液在室温下静置18~24h，待形成纤维网后，倾倒在洁净玻片上抗酸染色。或用金胺“O”进行荧光染色观察。取沉淀接种罗-琼培养基进行结核分枝杆菌的培养。新型隐球菌将脑脊液离心沉淀后，进行墨汁负染，可在黑色背景中观察到折光性很强的菌体和周围似晕轮样的透明荚膜，有时可见到生芽的新型隐球菌。5.粪便标本的采集粪便标本于急性腹泻期及未使用抗生素之前采取自然排出的粪便，挑选粘液、脓血部分，置无菌容器、保存液或增菌培养基中。可用肛门拭子。不能立即送检的标本应放入Cary-Blair运送培养基中。（1）直接涂片检查临床怀疑是霍乱弧菌、结核分枝杆菌感染或菌群失调需要大致估计菌群比例、二重感染（伪膜性肠炎、真菌性或葡萄球菌性肠炎）时进行直接涂片染色检查。霍乱弧菌的涂片检查取“米泔水”样粪便或肛门拭子涂片2张，干燥后用乙醇或甲醇固定，分别进行革兰染色和1：10稀释石炭酸复红染色，用油镜观察有无革兰阴性、鱼群样排列的弧菌。另外也可进行悬滴法动力试验和制动试验。菌群失调及菌交替症取粪便标本直接涂片，进行革兰染色油镜观察，根据菌群的形态和染色特征可大致描述菌群的情况。疑为伪膜性肠炎的患者标本中如发现大量革兰阳性呈葡萄状排列的球菌，则可报告“找到革兰阳性呈葡萄状排列的球菌”；如发现革兰阳性粗大杆菌、无荚膜，通常有位于菌体一端的卵圆形芽胞者，可报告“找到革兰阳性芽胞杆菌，疑似艰难梭菌”。结核分枝杆菌取半个指甲大小粪便块，与饱和盐水10~15ml搅和，静置，1~2h后取最上层液体作涂片，进行抗酸染色检查。（2）分离培养沙门菌属和志贺菌属直接接种肠道强选择性培养基（SS琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂）和弱选择性培养基（如MacConkey、EMB、中国蓝琼脂）各1个；携带者的检查，可将粪便标本接种于GN增菌液（适用于沙门菌属和志贺菌属）和亚硒酸盐或四硫磺酸盐增菌液（适用于沙门菌属）增菌后转种于肠道强和弱选择性培养基上观察菌落特征。霍乱弧菌可疑标本接种于碱性蛋白胨水中进行35℃增菌，同时接种含糖双洗平板、庆大霉素琼脂平板或TCBS琼脂平板。增菌培养6h后，取增菌液表层菌膜移种于上述平板中进行分离培养，同时取增菌液作革兰涂片染色和悬滴法动力试验和制动试验。副溶血性弧菌取可疑粪便（或可疑食物）接种于副溶血性弧菌增菌液中，同时划线接种于副溶血性弧菌选择性平板和SS平板上。肠致病性大肠埃希菌取可疑粪便标本接种在中国蓝平板（或MacConkey平板或EMB平板）。小肠结肠炎耶尔森菌将可疑标本接种于新耶尔森菌选择培养基（NYE）、MacConkey及SS琼脂平板。带菌者可将标本接种于1/15mol/LpH7.4~7.8的PBS中，在4℃进行冷增菌。空肠弯曲菌取可疑粪便或在Cary-Bair运送培养基中的粪便标本接种于Camp-BAP血琼脂或Skirrow血琼脂，或接种于CEM增菌液在微需氧环境下培养18~24小时后接种上述平板，在微需氧环境下培养42~48h。菌群失调及菌交替症要对粪便中的所有菌群进行观察，将粪便定量接种在肠道选择性培养基、需氧和厌氧血平板，甘露醇盐琼脂，沙保弱培养基等，观察各菌群的生长情况，进行鉴定后报告各菌群比例。怀疑艰难梭菌的菌交替症时，如为黄色、夹有伪膜的粪便应立即接种CCFA平板，进行厌氧培养。如为绿色、海水样粪便，应怀疑为金黄色葡萄球菌感染，接种甘露醇盐琼脂，有黄色菌落按葡萄球菌鉴定。如为真菌性腹泻，常发生在抗生素使用之后，将标本接种在沙保弱培养基及血平板上，进行鉴定。6.生殖道标本男性尿道、生殖器分泌物用无菌棉签将脓液采集在无菌试管中。由临床医师从肛门进行前列腺按摩，收集前列腺液。女性生殖道标本直视采集阴道后穹隆分泌物。盆腔脓肿的患者应消毒阴道后从后穹隆穿刺抽取脓液。子宫分泌物的采集采用双套管的方式插入子宫腔吸取分泌物。外阴分泌物对外阴部位的硬下疳,从其溃疡底部挤出少许组织液，以洁净玻片直接沾取，加盖玻片后送检。涂片检查对一般细菌和淋球菌的检查用革兰染色；梅毒螺旋体用暗视野显微镜或镀银染色法检查；结核分枝杆菌进行抗酸染色。培养检查一般细菌培养用血平板和MacConkey平板各一个；培养淋病奈瑟菌需要巧克力平板或卵黄双抗平板.7.脓液、胸腹水及分泌物等其它标本封闭性脓肿直接穿刺；疑为厌氧菌感染者，应立即将注射器内的空气排空，将针头插入橡皮塞中隔绝空气；开放性脓肿或瘘管从深部采取标本。标本直接涂片革兰染色发现细菌可以直接报告，然后用血平板接种培养。胸、腹水通过胸腔或腹腔穿刺获得，注入无菌试管中送检。（二）细菌形态检查显微镜是观察细菌形态的必备仪器。分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。1.不染色可以观察细菌的动力及运动等活体状况，由于细菌的折光性不强，不能清楚的看到细菌的形态特征和结构。标本的制作悬滴法、压滴法和毛细管法，后者主要用于厌氧菌的动力观察。用普通光学显微镜、暗视野显微镜或位相差显微镜观察。2.染色标本的形态检查细菌的染色可能是由于毛细管现象和染料的渗透作用、染料的溶解和吸收作用使染料进入细胞内，或由于电荷的吸附和结合使细菌着色。也可能与细菌细胞内的化学成分有关。此外细菌的染色性与细菌细胞膜