荧光定量PCR

张再超2012、03、25荧光定量PCRGenetimesTechInc叶佐东1.荧光定量PCR技术基础理论2.荧光定量PCR定量实验3.荧光定量PCR结果分析PresentationAgenda2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（RT-PCR或qPCR）:在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料，利用荧光信号积累对PCR反应的过程进行实时监控实现起始模板的精确定量。传统PCR:终点法检测，灵敏度、动态范围有限。qPCR:实时检测，灵敏度、动态范围更高、闭管更安全荧光定量PCRWhy？Page5BaselineFluorescence[DNA]CyclesCtCtThreshold荧光定量PCR-扩增曲线荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99CT值Ct值:PCR过程中，样品扩增荧光信号达到设定阈值时，所经过的扩增循环数。Ct值意义：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。PCR扩增方程荧光定量PCR方程Rn=RB+X0(1+E)nRs总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：单位信号强度X0：起始DNA数目E：PCR效率CTlg(1+E)=-lgX0+lg(Rn-RB)–lgRs荧光定量PCR线性关系左图：横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn；右图：横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值RT–RB即△Rn的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的RT–RB的对数都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。荧光定量PCR线性关系LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。SYBRGreenI™,EvaGreen,LCGreen,SYTO9TaqMan®MolecularBeaconsAndothers…DNAbindingProbebaseddetection(dual-labeledprobes)TaqTaq荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR-SYBRGreen法SYBRGreenI:染料结合至双链DNA的小沟处未结合时，荧光信号很弱当结合至DNA时，荧光信号增强1000倍非特异性结合：所有的双链DNA分子都能检出(特异性的扩增序列,引物二聚体etc.)•Dissociationcurve(融解曲线)：在使用SYBRGreen染料进行实验，需要分析融解曲线，以识别不同的产物。•原始数据融解曲线•Dissociationcurve(融解曲线)求导数据特异性产物非特异性产物非特异性产物实时荧光定量PCR-Taqman法unboundprobefreeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLightTaqmanChemistry:利用Taq酶外切酶活性和双标记寡核苷酸-探针.特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测可以在一次反应中同时检测多的不同的序列。•Taqman多重定量实验HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpamplicon荧光定量PCR分类绝对定量与相对定量的定义绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量：基本公式相对定量：双标准曲线法原理：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。双标准曲线法的特点：（a）考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；（b）其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；（c）该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。相对定量：2-△△CT法该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。相对定量：2-△△CT法相对定量：数据分析融解曲线分析对于核酸序列相同的PCR产物，其TM值也相同，而且其TM值在一个很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图。荧光定量PCR应用灵敏的序列检测和定量基因表达分析序列变异检测荧光信号检测病原体检测GMO分析质量控制法医学检测芯片结果验证相对定量ChIP染色体免疫共沉淀拷贝数分析CGH比较基因组杂交技术miRNA检测SNP检测/等位基因分型甲基化研究Immuno-PCR:用QPCR检测蛋白DNA/RNA定量蛋白稳定性试验报告基因活性分析Dilutionseries10-1to10-7ofaviralstandard病原菌检测Dilutionseries10-1to10-7ofaviralstandardmiRNA检测Figure1illustratestheqPCRquantificationworkflow.DilutethecontroltemplateandthelibrariesforquantificationtothepMrangeandrunqPCR.FromtheqPCRresults,calculatetheconcentrationofthequantifiedlibrariesanddilutethemtoastandardconcentration(e.g.,2nM).qPCR在NGS中应用AlleleDiscrimination/SNP‘sReal-Time:用荧光标记探针来测定DNA样品的等位基因构成.两个荧光探针分别用两个截然不同的荧光染料来标记，以辨别两个不同的等位基因，这个差别也许小到只是一个核苷酸不同。等位基因的presenceorabsence是基于终点荧光的读取是否满足于等位基因特异探针的自定义。（SNP全称SingleNucleotidePolymorphisms单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。SNP是第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关）。SNP分析荧光定量PCR实验1.核酸抽提2.RNA逆转录方法介绍3.荧光定量PCR方法介绍核酸抽提方法•异硫氰酸胍/苯酚混合试剂（Trizol）特点：便宜、简单、纯度一般、总RNA•硅胶膜法特点：快速、可重复性、高纯度高回收、单独收集、成本高紫外吸收法测定核酸的含量核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。紫外吸收法测定核酸的含量•1OD260相当于dsDNA50ug/ml，ssDNA33ug/ml和ssRNA40ug/ml。•通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值A260/A280）估计核酸的纯度。•纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0,若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。cDNA合成1、稀释模板RNAnuclease-freewaterRNA至合适终浓度2、试剂准备置冰面缓慢融化：nuclease-freewater、引物、RTmix等3、混合反应体系制备RTmastermix置冰面分装至无核酸酶PCR管加入模板RNA4、混匀反应体系轻轻摇匀或轻轻吸打离心5、逆转录孵育及热失活37℃，反应60min85℃，热灭活逆转录酶5min立即冷却至4℃产物保存于4℃或-20℃cDNA合成反应体系试剂体积(μl)5XRTMasterMix2DilutedcDNAtemplate2Nuclease-freeWater6总体积10荧光定量PCR操作步骤1、准备试剂置冰面缓慢融化：cDNAnucleasefreewater2×qPCRReactionMix2、稀释cDNA模板nucleasefreewater将cDNA模板稀释合适浓度3、混合反应体系制备qPCRmastermix置冰面分装至无核酸酶PCR管，加入模板cDNA4、混匀反应体系轻轻摇匀或轻轻吸打离心5、Real-timePCR反应Real-timeqPCR仪器设置上机6、数据分析扩增曲线、Ct值、溶解曲线Real-timePCR循环条件循环数步骤温度时间检测1预变性95℃10min否40变性95℃10secs否退火60℃20secs否延伸72℃10secs是1.误差分析及操作规范2.实验中污染的防控3.qPCR常见问题分析荧光定量PCR结果分析40误差分析及操作规范1、误差分析（1）实验方案本身的误差荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；2-△△CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；Taqman探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。（2）仪器设备引起的误差测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大；定量PCR仪的误差；耗材引起的误差，96空板封口膜透光性的差异等；误差分析及操作规范（3）相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差。（4）操作引起的误差样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引的误差。2、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。（1）样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。误差分析及操作规范（2）核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNAOD260/280＝2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做电泳检测。（3）得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。（4）对于精度要求较高的定量PCR，可做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5）做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。六、误差分析及操作规范（7）重复操作在提取样品RNA时，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复