临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3

临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制童永清武汉大学人民医院临床分子诊断中心武汉大学人民医院检验医学中心核酸扩增检测标本采集、运输、存储的重要性临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一核酸提取的重要性核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否临床PCR检验操作中最易出问题的环节分析前质量控制——标本采集、转运、预处理、储存等标本采集、运送和保存早特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本快标本应尽快送检，不能及时检测的标本放入低温容器内送检。短时间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融近标本应尽量取自病变部位或接近病变部位多标本的量不能太少净避免污染标本标本采集标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集部位的准备标本的类型和采集量采样质量的评价采样及运输容器标本采集中的防污染标本运送样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。检测标本类别标本血浆血清活检组织石蜡切片分泌物新鲜组织有目的地选择标本类别标本采集器皿标本采集器标本类型决定标本采集器标本采集外周血（HBV/EBV-DNA、HCV-RNA、HLA分型等）抗凝剂使用：首选EDTA或枸橼酸钠，不可使用肝素（强烈抑制PCR反应），不可溶血RNA检测：及时分离血浆，置于无RNase的离心管中送检EBV-DNA检测（小心使用）：小心分离LC，避免混入RBC标本采集其他体液（TB/EBV-DNA等病原）痰：深部痰液，不是唾液胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂尿液：尿道口消毒，中段尿鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）采样时要采到上皮细胞充分洗涤拭子切片组织标本采集肿瘤组织40%：直接提取核酸肿瘤组织40%：必须采用其它方式标本保存&运输（人）标本采集后不得存放于护士站过夜血液标本/体液等：检测DNA，采集后1h内送检，检测RNA，立即送检（30分钟内）活检组织：检测DNA，2h内送检，检测RNA，立即送检（30分钟内）石蜡切片：24h内送检标本保存&运输（病原体）采血后不得长期存放于护士站过夜病原DNA检测：不超过6h，2h内分离血浆/血清短期保存：4℃长期保存：-20℃病原RNA检测：采血后尽快分离血浆&提取RNA短期保存：-20℃，避免反复冻融长期保存：-70℃，避免反复冻融标本长期保存和建库液氮罐超低温冰箱/柜低温冰箱/柜常温冰箱适当温度保存标识清楚、记载详细保存时间信息化管理分析中质量控制—核酸提取DepartmentofHealthandHumanServices,CentersforMedicareandMedicaidServices.Clinicallaboratoryimprovementamendmentsof1988;finalrule.57FederalRegister7170(codifiedat42CFR493.1265);57FederalRegister7176(codifiedat42CFR493.1445(e)(5).核酸提取DNA以正常人同类标本做对照不同标本类型采用不同提取方法4℃保存，长时间-20℃保存RNA以正常人同类标本做对照不同标本类型采用不同提取方法严格按照操作手册，避免降解-20℃保存，长时间-70℃保存制定标准化的核酸提取文件实验操作手工操作为主，固定人员，熟练操作，保持手法的一致性不同厂家提取试剂盒不可混用按质量管理手册进行样品核酸提取的发展方向酚氯仿/乙醇沉淀Chelex煮沸玻璃奶吸附硅胶膜/离心柱磁珠法√√样品核酸提取的发展方向高得率高纯度低拷贝样品的检出，PCR试剂的高灵敏度多重PCR；无杂质，PCR不会被抑制稳定均一可靠的检验结果自动化高效提取，高通量，一体化未来核酸提取技术的必备要素一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。核酸的分离纯化核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。DNA提取的经典方法即所谓的”酚-氯仿提取法”RNA提取的独特性临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。RNA提取所用器皿的处理经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA.实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。RNA提取所用溶液的准备对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液。RNA提取中RNase污染的控制实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。策略是：在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。在RNA提取实验中，应勤换手套。RNA提取的常用方法表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。核酸提取的改良方法旋转离心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自动核酸纯化仪旋转离心柱（SPINCOLUMN）属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离心柱系统通常可分为三个部分：第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则不相亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。临床标本中PCR反应抑制物内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。注意事项肝素的作用机理肝素对MLV逆转录酶和TAQDNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。在标本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃2小时)可去除肝素的抑制作用。血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin）血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。2）亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活性及协调红细胞内血红蛋白成分的合成。也观察到，氯化高铁血红素通过直接作用于DNA聚合酶，与成为一个与靶DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争性抑制剂。3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有机物质包裹所致，使得靶DNA不能接触DNA聚合酶。血红蛋白1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样。IgGIgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制去除或减轻抑制的一些方法NaOH处理可中和临床标本中的TaqDNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。去除或减轻抑制的一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对TaqDNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加rTth或TaqDNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。核酸纯化核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。提取核酸的质量纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果临床标本核酸提取中可能存在的非源自标本的抑制和干扰物质核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。核酸样本制备及扩增检测的质控对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施核酸提取及扩增有效性的质控对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施质控措施：采用内质控（internalcontrol,IC）（通常称为内标）的方法内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。核酸提取的质量控制提取过程质控设立强阳性质控品提取过程中加入带颜色的内标设立临界阳性质控品各质控品和内标需符合说明书标准感染性疾病的分子诊断实例1乙型肝炎病毒检测乙型肝炎二对半检测大三阳：1、3、5阳性小三阳：1、4、5阳性1、标本类型：血浆、血清（血浆血清10倍）2、