QIAGEN操作说明

Qiagen基因组提取试剂盒中文操作说明QIAampDNABloodMiniKit简介：QIAGEN公司出品的QIAampDNABloodMiniKit适用于使用微型离心机或真空处理从全血、血浆、血清、血沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全血样本，样品量可达200μl。整套基因组的操作时间约为20–40分钟，一般可从200μl健康全血中获得4–12μgDNA，洗脱体积可在50–200μl范围。抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：二价阳离子和蛋白完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集。开始前的注意事项：1.所以的离心步骤需要在室温（15-25℃）进行2.如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrierDNA）3.200μl全血样品可以得到约3-12μgDNA开始前的准备工作：1.将样品平衡到室温（15-25℃）2.将水浴或是金属浴加热到56℃，以备第4步使用3.将BufferAE或蒸馏水平衡到室温，用于第11步的洗脱4.确保BufferAW1、AW2以及QIAGEN蛋白酶已经按照说明配置完毕5.如果在BufferAL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：1.吸取20μlQIAGEN蛋白酶（或者蛋白酶K）至1.5ml离心管的底部。2.加入200μl待提取基因组的样品至离心管中。可以加入不超过200μl的全血、血浆、血清、血沉棕黄层，或者溶于200μlPBS中不超过5*106的淋巴细胞。如果样品体积不足200μl，请使用PBS补足。前两步的顺序也可以调换，即将蛋白酶加入样品中，但此时需要注意充分混匀。3.加入200μlBufferAL至样品中，涡旋振荡15s混匀。完全混匀以得到均一化的溶液对于保证样品的充分裂解非常重要如果样品体积大于200μl，请等量增加蛋白酶和BufferAL的量。大体积样品推荐使用Midi或Maxi试剂盒。操作时注意，请不要将QIAGEN蛋白酶（或蛋白酶K）直接加入BufferAL中。4.56℃孵育10min。DNA得率在该条件下已经达到最大值，延长孵育时间不会进一步提高得率。5.快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的液滴。6.加入200μl（样品等体积）的乙醇（96-100%），涡旋振荡15s混匀。振荡完毕后，快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的液滴。7.将步骤6得到的混合物转移至QIAampMini离心管柱(在一个2ml的收集管中)注意不要弄湿边缘的环。扣上盖子（在离心过程中关闭每个离心管的盖子以防止离心过程中产生气溶胶），6000g（8000rpm，选择低速离心的目的是减少噪音，使用更高的转速不会影响DNA最终的得率和纯度，在样品为血沉或者淋巴细胞时，推荐使用最高转速以防止堵塞）离心1min。将QIAampMin离心柱放入一个新的干净2ml接收管中（已提供），将滤液连同使用过的收集管丢弃。8.小心打开QIAampMini离心柱，加入500μlBufferAW1（注意不要将边缘环弄湿）。盖紧盖子，6000g（8000rpm）离心1min。将QIAampMini离心柱转移至一个新的2ml收集管中（已提供），将滤液连同使用过的收集管丢弃。即使最初加入的样品量大于200μl，此步也不需要增加BufferAW1的用量。9.弃滤液，小心打开QIAampMini离心柱，加入500μlBufferAW2（注意不要将边缘环弄湿）。盖紧盖子，最大转速（20000g；14000rpm）离心3min。10.推荐步骤：将QIAampMini离心柱转移到一个新的2ml收集管（试剂盒里未提供，可以使用我们平时使用的1.5ml离心管，将盖子剪掉，作为收集管）。最大转速离心1min。该步骤可以帮助降低BufferAW2残留的可能性。11.将QIAampMini离心柱转移到一个新的1.5ml收集管（未提供）。小心打开离心柱，加入200μlBufferAE或双蒸水（洗脱体积大于200μl时不适用于1.5ml收集管，因为此时离心柱下缘会于洗脱液接触，从而导致在离心过程中可能产生气溶胶；洗脱体积少于200μl会显著增加洗脱液中DNA的浓度，但会降低总的DNA得率；对于少于1μg的DNA来说，推荐使用50μl的洗脱液；使用100μl洗脱液洗涤2次与使用100μl洗脱液洗涤一次的效果差不多）。室温（15-25℃）孵育1min（一般来说，孵育时间延长至5min可以提高得率），然后6000g（8000rpm）离心1min。如果继续加入200μlBufferAE进行二次洗脱，可以将得率提高约15%。