拮抗油菜菌核病菌的链霉菌分离筛选与鉴定

中国油料作物学报ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１３，３５（１）：０６９－０７３ｄｏｉ：１０．７５０５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－９０８４．２０１３．０１．０１２拮抗油菜菌核病菌的链霉菌分离筛选与鉴定胡　磊，牛世全，景彩虹，达文燕，朱学泰，韩建山，程　晓，张爱梅（西北师范大学生命科学学院甘肃兰州，７３００７０）　　摘要：从甘肃省河西走廊改良后的盐碱地分离链霉菌用于油菜菌核病菌的拮抗研究，并对拮抗菌进行鉴定。分离得到１０株不同菌落形态的链霉菌，其中有２菌株对油菜菌核病有拮抗作用，编号Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２。与油菜菌核病进行对峙培养结果发现，Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２抑菌圈直径分别为１．２和０．９ｃｍ；离体叶菌丝接种试验表明，Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２对油菜菌核病菌的防治效果分别达６３．５％和４９．１％；Ⅳ２２－３－１２能在油菜菌核上定殖并寄生分解菌核，同对照相比菌核萌发率下降１８．２％；通过形态培养特征、生理生化特征和１６ＳｒＤＮＡ鉴定表明，Ⅳ２２－３－３为产水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｎｓ），Ⅳ２２－３－１２为球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）。关键词：油菜；核盘菌；菌核；盐碱地；链霉菌；生物防治中图分类号：Ｓ５６５．４０６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００７－９０８４（２０１３）０１－００６９－０５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅｐａｔｈｏｇｅｎＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍＨＵＬｅｉ，ＮＩＵＳｈｉ－ｑｕａｎ，ＪＩＮＧＣａｉ－ｈｏｎｇ，ＤＡＷｅｎ－ｙａｎ，ＺＨＵＸｕｅ－ｔａｉ，ＨＡＮＪｉａｎ－ｓｈａｎ，ＣＨＥＮＧＸｉａｏ，ＺＨＡＮＧＡｉ－ｍｅｉ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓａｌｉｎｅ－ａｌｋａｌｉｓｏｉｌｓｏｆＨｅｘｉＣｏｒｒｉｄｏｒｉｎＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｎａｍｅｄⅣ２２－３－３ａｎｄⅣ２２－３－１２ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅ．Ｄｅｔａｃｈｅｄｌｅａｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｔｅｓｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｈａｄｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆ６３．５％ａｎｄ４９．１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，Ⅳ２２－３－１２ｃｏｕｌｄｃｏｌｏｎｉｚｅｏｎｔｈｅｓｃｌｅｒｏｔｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｌｉｎｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ），Ⅳ２２－３－１２ｄｅｃｒｅａｓｅｄ１８．２％ｏｆｔｈｅｓｃｌｅｒｏｔｉａｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｓｗｅｌｌａｓｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｐｐｏｒｔｅｄｓｔｒａｉｎⅣ２２－３－３ｔｏｂｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｄｏｇｅｎａｎｓ，ａｎｄｓｔｒａｉｎⅣ２２－３－１２ｔｏｂｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒａｐｅｓｅｅｄ；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；Ｓｃｌｅｒｏｔｉａ；Ｓａｌｉｎｅ－ａｌｋａｌｉｓｏｉｌｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌ收稿日期：２０１２０９２６基金项目：国家自然科学基金（３１２６０１３４；３０９６００７８）；２００９年度人事部留学人员科技活动择优项目作者简介：胡　磊（１９８７－），男，硕士研究生，微生物生态专业通讯作者：牛世全（１９６３－）男，教授，研究方向为微生物生态，Ｅ－ｍａｉｌ：[e-mail]　　核盘菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）是引起油菜菌核病的一种世界性顽固病害［１，２］，是油菜生产中的重要病害之一。核盘菌的初侵染源主要是混有菌丝的土壤、残秸和种子。在温、湿度适宜条件下，菌核萌发长出子囊盘，子囊盘散发出子囊孢子，成熟后子囊孢子从子囊内喷出，随气流传播，侵染花瓣和老叶。带病的花瓣、老叶与健茎、健叶接触，即引起发病，以后又通过接触而扩展蔓延，最终在油菜茎秆中形成菌核。近年来，由于气候影响、品种繁多、栽培管理粗放、施肥水平提高等原因，油菜菌核病危害更加严重。菌核病主要危害茎秆，引起植株早枯，角果减少，种子皱瘪，千粒重和出油率降低，产量下降。据典型田块调查和大田普查，常年株发病率高达１０％～３０％，严重的达７０％以上，极大地影响油菜产量和品质［３］。长期以来，油菜菌核病防治主要采用农业防治、化学防治等综合防治的方法［４］，虽然对生物防治的研究报道较多［５，６］，但大部分研究结果仍然停留在实验室阶段；对于利用生防细菌防治的研究也主要为筛选试验，对其防病机理缺乏深入研究，研究结果很少能广泛应用于田间大面积防治；从保护农业环境和提高食品安全的内在需要出发，生物防治前景广阔［７，８］。目前，尚未发现对油菜菌核病有高抗性的油菜品种或抗源材料［９］，而化学农药又因其残留和花期施药不便等问题受到限制。因此，生物防治受到越来越多的关注。国内外在生物防治油菜菌核病方面已报道有抑制作用的大多为真菌和细菌，如木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）［１０］、粘帚霉（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍｓｐｐ．）［１１］、盾壳霉（Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｍｉｎｉｔａｎｓ）［１２］和芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）［１３］等，而链霉菌的报道则较少。链霉菌是放线菌目中的一个大属，是一类极具有开发潜力的生防资源菌。链霉菌的分类主要是依据链霉菌的形态和生理生化特征，同时辅以分子手段，如１６ＳｒＤＮＡ，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交等。本研究从甘肃省河西走廊改良后的盐碱土壤中分离链霉菌，以期从中筛选出对油菜菌核病菌有生防潜能的链霉菌，这将为生物防治作物病害提供新的菌种资源。１　材料与方法１．１　油菜菌核的采集采集地为甘肃省天水市秦安县，种植的油菜品种是青杂５号。在油菜收获后，从被菌核病为害的油菜茎秆中采集菌核，风干、室温贮藏备用。１．２　土壤的采集采集地为甘肃省酒泉市瓜州县，其改良后的盐碱土壤基本理化性状为ｐＨ６．７，有机质７．９ｇ／ｋｇ，全氮０．０４％，速效磷１２．４ｍｇ／ｋｇ，速效钾１１．９ｍｇ／ｋｇ。前茬作物是玉米。除掉１～２ｃｍ表层土壤，采集２～１０ｃｍ的耕作层土壤，共采５个点，每点２～３ｋｇ，风干后混合备用。土壤类型为灰钙土。１．３　油菜菌核病菌的分离油菜菌核用０．１％升汞消毒３ｍｉｎ，再在无菌水中连续漂洗７次，将菌核放入含有固体ＰＤＡ（土豆、蔗糖）［１４］培养基的培养皿上，每皿２～３个菌核，２０～２２℃培养５～７ｄ，在菌核周边生长出的白色菌丝为油菜菌核病菌（命名为Ｓ－１）。１．４　链霉菌的分离采用系列稀释平板法进行分离［１４］，所用培养基为高氏一号（分离时添加重铬酸钾７０ｍｇ／Ｌ）的固体培养基［１４］；２８℃培养７～１０ｄ；２５０ｍＬ三角瓶装１００ｍＬ液体的高氏一号，接种分离得到的链霉菌菌株，在２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１０ｄ，发酵液用于离体叶菌丝体接种实验。１．５　对病原菌的体外拮抗试验将分离到的链霉菌菌株用无菌的生理盐水制成含孢子量≥１×１０３个／ｍＬ的孢子悬浮液，此孢子悬浮液涂抹在固体的高氏一号培养基上，培养１０ｄ后备用。分离到的油菜菌核病病菌Ｓ－１的菌丝体被接种在含有ＰＤＡ固体培养基的培养皿中心。当菌丝体即将长满整个培养皿时，在菌落的外圈用无菌的打孔器（直径０．４ｃｍ）垂直挖取含菌丝琼脂块，放入新的ＰＤＡ培养皿中央，然后在它左右和上下各２．０ｃｍ处等距离放上１个用无菌的打孔器（直径０．４ｃｍ）垂直挖取的含链霉菌琼脂块和无菌琼脂块（对照），置２２℃培养５ｄ后观察结果，试验重复５次。１．６　离体叶菌丝体接种实验在田间选择生长整齐的油菜植株，采集各株地上相同部位、叶龄和大小一致、无病虫感染的绿色叶片，每株采１片，用清水冲洗干净后，放入垫有纱布的搪瓷盘中，纱布湿润，叶柄用湿纱布压住，叶片用玻璃棒或试管垫起，每盘相对放置２排叶片，其中１排为对照。接种用的菌丝体（Ｓ－１）取自即将铺满平板的菌落外周，菌丝贴于叶面。接种前２ｈ用毛笔蘸取经过３０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ离心的链霉菌发酵液上清液涂于叶面，对照涂抹无菌生理盐水，每个处理１０片叶。叶片接种后，瓷盘置于２２～２５℃，光照保湿条件下培养，光照时间１６ｈ，光照强度８０μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１，４８ｈ后测量病斑大小。１．７　链霉菌菌株对油菜菌核萌发率的影响在无菌的培养皿（直径９ｃｍ）中放入无菌菌核（用０．１％升汞消毒３ｍｉｎ，无菌水中连续漂洗７次）３０粒，将链霉菌菌株用无菌的生理盐水配制成１×１０３个／ｍＬ孢子悬浮液，每个菌核滴加０．０１ｍＬ，盖上盖子，每个菌株３次重复，共９０个菌核，用无菌生理盐水做对照。在２５℃的培养箱中培养３周后，菌核用０．１％升汞消毒３ｍｉｎ，无菌水中连续漂洗７次，将菌核放入ＰＤＡ上，２２℃下培养４ｄ后观察菌核的萌发率。１．８　链霉菌的鉴定１．８．１　形态和培养特征鉴定　参考《链霉菌鉴定手册》［１５］。采用平皿插片法观察菌株的形态特征。观察高氏一号培养基中生长的链霉菌的气生菌丝（以下简称气丝）、基生菌丝形态特征。在高氏一号固体培养基上观察放线菌菌落的培养特征。０７中国油料作物学报　２０１３，３５（１）１．８．２　生理生化鉴定　包括牛奶凝固胨化、明胶液化、淀粉水解、几丁质降解、纤维素分解、硝酸盐还原、黑色素和Ｈ２Ｓ产生。１．８．３　１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩增及序列测定　提取菌株的总ＤＮＡ后，进行ＰＣＲ扩增。扩增引物序列为：正向引物：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′；反向引物：５′－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′。经测序获得菌株１６ＳｒＤＮＡ序列，将序列通过ＧｅｎＢａｎｋ中核酸数据库进行比对，采用ＭＥＧＡ３．１软件构建系统发育树，并且进行同源性分析。２　结果与分析２．１　链霉菌的分离与对菌核病的拮抗作用从改良后的盐碱土壤中，在高氏一号培养基上共分离到１０株疑似链霉菌菌株。将这１０株菌株进行拮抗实验。实验结果表明，仅有２个菌株即Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２对油菜菌核病菌有不同程度的拮抗活性，抑菌圈直径分别为１．２±０．０７ｃｍ和０．９±０．１０ｃｍ（图１）。图１　Ⅳ２２－３－３对油菜菌核病菌的拮抗作用Ｆｉｇ．１　ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆⅣ２２－３－３ｓｔｒａｉｎａｇａｉｎｓｔＳ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ图２　分离菌Ⅳ２２－３－３对离体叶菌丝扩展的抑制作用Ｆｉｇ．２　ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆⅣ２２－３－３ｓｔｒａｉｎｔｏＳ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｏｎｒａｐｅｓｅｅｄｌｅａｖｅｓ２．２　拮抗菌对菌核病菌的防治效果离体叶菌丝接种试验表明，Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２对菌核病菌丝扩展有一定的阻碍作用，其中经拮抗活性较高的菌株菌Ⅳ２２－３－３处理的叶片平均病斑３．０３±０．０８ｃｍ２，而对照为８．３１±０．２２ｃｍ２，其防治效果达６３．５％（图２）；Ⅳ２２－３－１２处理的叶片平均病斑４．２３±０．１３ｃｍ２，同对照相比，其防治效果达４９．１％。２．３　分解菌核对菌核萌发率的影响３周后，观察Ⅳ２２－３－３和Ⅳ２２－３－１２在油菜菌核上生长情况。Ⅳ２２－３－３接种后的效果与对照相同，表明它不能在菌核上生长；但Ⅳ２２－３－１２能在菌核上生长（图３