第11章--固相膜免疫分析技术

第一章血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第十一章固相膜免疫分析技术徐广贤目录第一节概述第二节免疫层析试验第三节免疫渗滤试验第四节斑点酶免疫吸附试验第五节免疫印迹试验第六节影响固相膜免疫试验的主要因素第七节固相膜免疫分析技术的临床应用第一节概述重点提示固相膜免疫分析技术常用的固相膜和标志物固相膜的技术要求固相膜免疫分析技术是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜渗滤作用或毛细管虹吸作用使样本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物或酶标记物与之反应形成肉眼可见的显色结果。常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙（nylon）膜硝酸纤维素（nitrocell-ulose，NC)膜NC膜或尼龙膜是常用的固相膜常用的标志物酶和有色微粒子彩色胶乳荧光素胶体金和胶体硒等其中以胶体金和荧光素最为常用固相膜的技术要求孔径：穿流法的膜一般选择0.4μm左右；横流法的膜可选择5μm〜10μm。流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示。均一性：优质的膜具有良好的均一性。第二节免疫层析试验重点提示原理常用的免疫层析试验胶体金免疫层析试验的测定模式荧光免疫层析试验技术要点原理免疫层析试验是以硝酸纤维素膜为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过检测标记物胶体金颗粒或荧光素等，在短时间内（20min)聚集而得到直观的试验结果（显色）。常用的免疫层析试验根据标记物的不同，免疫层析试验可以分为：胶体金免疫层析试验：标记物为胶体金，多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。荧光免疫层析试验：标记物为荧光素，标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。胶体金免疫层析试验的测定模式双抗体夹心法检测大分子抗原竞争法检测小分子抗原间接法双抗体夹心法检测大分子抗原G处为金标特异性抗体，T处为包被特异性抗体，C处为包被抗免疫球蛋白抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。图11-1免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图竞争法检测小分子抗原图11-2免疫层析试验竞争法原理示意图G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗金标抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现红色的线条，实验结果为阴性。间接法利用间接法检测抗体时，待测血清标本中大量的非特异性IgG可以与特异性IgG竞争性结合胶体金标记的抗人IgG，从而影响试验的敏感性，为了消除其影响，常采用反流免疫层析法排除非特异性抗体对测试的干扰。荧光免疫层析试验荧光免疫层析试验是在免疫层析技术的基础上，采用荧光素标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。荧光免疫层析实验与胶体金免疫层析实验的基本步骤是一样的，但所用的标记物不一样，前者采用的是荧光素，后者采用的是胶体金。常用的方法有夹心法、竞争法等。技术要点胶体金层析试验：加样、结果判定。荧光层析试验：不同的荧光标记物具有不同的检测波长，需根据试剂盒的荧光标记物的特性，选择合适的检测波长，或使用试剂盒提供的专用荧光检测仪器。第三节免疫渗滤试验重点提示原理测定模式技术要点原理DIGFA是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加样品、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上的相应抗原或抗体发生反应，起到亲和层析的浓缩作用，达到快速检测的目的。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。测定模式1.双抗体夹心法测抗原：AB包被抗体的试纸滴加金标抗体滴加待检样品于试纸上测定模式2.间接法测特异性抗体：试剂盒组成主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。试剂盒一般都设有质控点，质控点的大小或形状都不同于检测点，有的用大小点区分、有的用点横线区分，有的用横竖线区分。图11-3DIGFA结构示意图技术要点加样：将渗滤装置平放于实验台面上，于小孔内依次滴加含待测样品及相应的试剂。结果判定：在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地表示阳性反应的强弱。第四节斑点酶联免疫吸附试验重点提示原理技术要点方法学评价原理Dot-ELISA的实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA所用载体为NC膜。其原理为样品中的抗体或抗原与预先包被在NC膜上的抗原或抗体发生抗原抗体反应，然后再加入相应的酶标二抗进行反应，反应结束后，通过酶催化底物，形成有色的沉淀物，产生显色反应，根据染色条带或斑点的有无或深浅，对抗体或抗原进行检测。阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色条带或斑点。图11-4Dot-ELISA示意图技术要点抗原包被：优化抗原的浓度。抗原抗体反应：滴加样品血清，待检抗体与NC膜上抗原结合。确定酶结合物最佳稀释度：一般以阴性样品不显色而阳性样品显色最强的酶结合物稀释度为最佳稀释度。显色反应：在盐酸联苯胺和过氧化氢为底物时，溶液pH值应在5.8～6.0，此时反应最灵敏。方法学评价优点：1.吸附蛋白能力强2.可同时检测多种抗体3.其它：实验和结果判断不需特殊设备条件，结果可长期保存第五节免疫印迹试验重点提示原理技术要点方法学评价原理技术要点抗原印迹与包被抗原抗体反应检测抗原等蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上放射自显影法底物化学发光法底物荧光法和底物显色法方法学评价特异性强，用于病原体确认13同时检测多种抗体4膜条可重复检测应用吸附蛋白能力强22第六节影响固相膜免疫试验的主要因素重点提示试剂方面标本方面实验过程影响因素：试剂试剂的选择：注意试剂的注册号、批号、有效期和检验合格证等；不同批号的试剂不能混用；不能使用过期的试剂。试剂的准备：试剂在开封前应检查是否漏液、漏气；使用前要在室温（18℃～25℃）下平衡20min～30min。影响因素：标本标本处理：临床检测的标本有痰液、尿液、粪便、棉拭子、血清和血浆等。检测前，需进行相应的前处理，如痰液或粪便，需用缓冲液或生理盐水稀释后，低速离心，取上清进行检测。标本保存：对于采集的标本如不能立即检测，需要保存在2℃～8℃，不超过24小时，超过24小时以上，需保存在-20℃以下，忌反复冻融。影响因素：实验过程温度及时间结果判定检测前要平衡至室温（18～25℃）后再开袋使用。无特殊说明，检测的温度为18～25℃，时间在3Omin以内。一些胶体金诊断试剂条只用于初步诊断，确诊需采用免疫印迹实验进行。试剂条平衡第七节固相膜免疫分析技术的临床应用临床应用类别检验项目检测方法心肌标志物乳酸脱氢酶(LD)同工酶谱肌酸激酶(CK-MB)及其同工酶免疫印迹试验、荧光免疫层析试验N-端脑利钠肽前体、心肌肌钙蛋白I、心钠肽(ANP)和脑钠肽(BNP)等酶联免疫斑点法感染性疾病乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)胶体金免疫层析试验丙型肝炎抗体(抗-HCV抗体)RIBA人类免疫缺陷病毒抗体（HIV）1/2型抗体胶体金免疫层析试验、免疫印迹试验自身免疫疾病抗Sm抗体、抗U1RNP抗体、抗Rib抗体、抗ssA抗体、抗ssB抗体、抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体、抗Ro60抗体等。RIBA、酶联免疫斑点法、胶体金免疫层析试验抗丙酮酸脱氢酶复合物（AMA-M2）、肝肾微粒体（LKM-1）、细胞色素P450、细胞浆肝抗原(LC-1)、可溶性肝抗原-肝胰抗原（SLA/LP）抗体检测。RIBA抗丝氨酸蛋白酶3（PR3）、髓过氧化物酶（MPO）、肾小球基底膜（GBM）抗体。斑点渗滤法肿瘤标志物抗前列腺特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)对、糖蛋白抗原（CA50、CA125、CA153、CA199）等胶体金免疫层析试验生殖相关人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金免疫层析试验性相关疾病淋病、尖锐湿疣、生殖器疱疹病毒（HSV)-IgG、梅毒螺旋体抗体。胶体金免疫层析试验、WB、乳胶免疫层析法过敏原血清总IgE、总IgG、特异性IgE胶体金免疫层析试验毒品大麻、吗啡、甲基安非他明、氯胺酮(K粉)、美沙酮等胶体金免疫层析试验本章小结固相膜免疫技术是在酶联免疫吸附试验、单克隆抗体技术、荧光免疫技术、胶体金免疫技术和固相膜的基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，常用的有胶体金层析实验、荧光免疫层析实验、斑点渗滤实验、斑点酶免疫吸附实验和Western-blot、重组免疫印迹试验等。具有检测速度快、灵敏度高，样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小，操作简单，不需贵重仪器，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，广泛应用于临床检测，是床边检验的主要方法。Thankyou!