rubp羧化酶活性测定方法

RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBPcarboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。Rubisco普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。同时，Rubisco也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+-------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10.5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（activeunit）表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU=1μmol/min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。【实验步骤】1.酶粗提液的制备：取新鲜植物叶片10g，洗净擦干，在匀浆器中加入10ml预冷的提取介质，高速匀浆30S，停30S，再匀浆30S，反复3次，匀浆经4层纱布过滤，滤液于4度下20000g离心15min，取上清液即为粗酶提取液。置0度保存备用。2.活力测定：按照下表配制反应体系试剂加入体积/ml5mmol/LNADH0.250mmol/LATP0.2粗酶液0.150mmol/L磷酸肌酸0.20.2mmol/LNaHCO30.2反应介质1.4160U/L磷酸肌酸激酶0.1160U/L3-磷酸甘油酸激酶0.1160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶0.1蒸馏水0.3将配好的反应体系摇匀，倒入比色杯中，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上测定340nm处的吸光度，作为零点值。将0.1mlRuBP加入比色杯中，并立刻计时，每隔30S测定1次吸光度，共测3min，一步加RuBP的作为对照。以零点到1min内吸光度下降值计算酶活力。3．结果计算Rubisco活力=（E0-E1）*Vt/(2*d*ξ*Δt*Vs)式中，E0、E1分别为反应前后反应液的A340；Δt为E0到E1的时间（min）;ξ为1μmolNADH的吸光系数（6.22）；d为比色杯的光径（cm）；V为酶液总量（ml）;Vs为反应液体积（ml）；酶活力单位[mmolCO2/(min*ml)酶液]；2为每固定1molCO2有2molNADH被氧化。【注意事项】RuBP很不稳定，使用过程中注意在PH5.0-6.5范围内，以10mmol/L的浓度保存于-20℃冰箱中。