GB4789342012食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定

中华人民共和国国家标准GB4789.34—2012食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定中华人民共和国卫生部发布2012-05-17发布2012-07-17实施GB4789.34—2012I前言本标准代替GB/T4789.34-2008《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》。本标准与GB/T4789.34-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了培养基和试剂；——删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定和双歧杆菌的计数方法。GB4789.34—20121食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定1范围本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）气相色谱仪配FID检测器；c）冰箱：2℃～5℃；d）天平：感量0.1g；e）无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；f）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头；g）无菌锥形瓶：500mL、250mL。3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基：见附录A中的A.1。3.2PYG液体培养基：见附录A中的A.2。3.3甲醇：分析纯。3.4三氯甲烷：分析纯。3.5硫酸：分析纯（体积比）。3.6冰乙酸：分析纯（体积比）。3.7乳酸：分析纯。3.8乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。3.9乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3.10乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。3.11乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。GB4789.34—201224鉴定程序双歧杆菌鉴定程序见图1。图1双歧杆菌鉴定程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。5.1.2以无菌操作称取25g（mL）样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。5.2稀释及涂布培养步骤厌氧，48h36℃±1℃样品25g（mL）+225mL灭菌生理盐水10倍系列稀释革兰氏染色，过氧化氢酶试验报告选择2个～3个适当稀释度，各取0.1mL分别加入到双歧杆菌琼脂平板进行涂布挑取菌落接种于双歧杆菌琼脂平板接种PYG液体培养基生化反应测定乙酸、乳酸厌氧，48h36℃±1℃厌氧，48h36℃±1℃GB4789.34—201235.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。5.2.3根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液，用L棒在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布,每个稀释度作两个平皿。置36℃±1℃温箱内培养48h±2h，培养后选取单个菌落进行纯培养。5.3纯培养挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养48h。5.4镜检及生化鉴定5.4.1涂片镜检双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.4.2生化鉴定过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见附录B。5.5有机酸代谢产物测定气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,见附录C。6报告根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1（5.5），报告双歧杆菌属的种名。GB4789.34—20124附录A培养基A.1双歧杆菌琼脂培养基A.1.1成分蛋白胨15.0g酵母浸膏2.0g葡萄糖20.0g可溶性淀粉0.5g氯化钠5.0g西红柿浸出液400.0mL吐温801.0mL肝粉0.3g琼脂粉15.0g～20.0g加蒸馏水至1000.0mLA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液称取半胱氨酸0.5g，加入1.0mL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.1.2.2西红柿浸出液将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121℃高压灭菌15min～20min。A.1.2.3培养基将A.1.1所有成分加入蒸馏水中，加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH6.8±0.2。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。A.2PYG液体培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-HCl0.25g盐溶液20.0mL维生素K1溶液0.5mL氯化血红素溶液5mg/mL2.5mL加蒸馏水至500.0mLA.2.2制法A.2.2.1盐溶液称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g，加蒸馏水至1000mL。A.2.2.2氯化血红素溶液（5mg/mL）称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL中，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min～20min。GB4789.34—20125A.2.2.3维生素K1溶液称取维生素K11.0g，加无水乙醇99mL，过滤除菌，冷藏保存。A.2.2.4培养基除氯化血红素溶液和维生素K1溶液外，A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K1溶液，冷至50℃使用。GB4789.34—20126附录B双歧杆菌菌种主要生化反应双歧杆菌菌种主要生化反应见表B.1。表B.1双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.bifidum)婴儿双歧杆菌(B.infantis)长双歧杆菌(B.longum)青春双歧杆菌(B.adolescentis)动物双歧杆菌(B.animalis)短双歧杆菌(B.breve)1甘油－－－－－－2赤癣醇－－－－－－3D-阿拉伯糖－－－－－－4L-阿拉伯糖－－+++－5D-核糖－+－+++6D-木糖－++d++7L-木糖－－－－－－8阿东醇－－－－－－9β-甲基-D-木糖甙－－－－－－10D-半乳糖d+++d+11D-葡萄糖++++++12D-果糖d++dd+13D-甘露糖－++－－－14L-山梨糖－－－－－－15L-鼠李糖－－－－－－16卫矛醇－－－－－－17肌醇－－－－－+18甘露醇－－－－－－19山梨醇－－－－－－20α-甲基-D-甘露糖甙－－－－－－21α-甲基-D-葡萄糖甙－－+－－－22N-乙酰-葡萄糖胺－－－－－+23苦杏仁甙（扁桃甙）－－－++－24熊果甙－－－－－－25七叶灵－－+++－26水杨甙（柳醇）－+－++－27D-纤维二糖－+－d－－28D-麦芽糖－+++++29D-乳糖++++++30D-蜜二糖－+++++31D-蔗糖－+++++32D-海藻糖（覃糖）－－－－－－33菊糖（菊根粉）－－－－－－34D-松三糖－－++－－35D-棉籽糖－+++++GB4789.34—20127表B.1（续）双歧杆菌菌种主要生化反应编号项目两歧双歧杆菌(B.bifidum)婴儿双歧杆菌(B.infantis)长双歧杆菌(B.longum)青春双歧杆菌(B.adolescentis)动物双歧杆菌(B.animalis)短双歧杆菌(B.breve)36淀粉－－－+－－37肝糖（糖原）－－－－－－38木糖醇－－－－－－39龙胆二糖－+－+++40D-松二糖－－－－－－41D-来苏糖－－－－－－42D-塔格糖－－－－－－43D-岩糖－－－－－－44L-岩糖－－－－－－45D-阿糖醇－－－－－－46L-阿糖醇－－－－－－47葡萄糖酸钠－－－+－－482-酮基-葡萄糖酸钠－－－－－－495-酮基-葡萄糖酸钠－－－－－－注：+表示90％以上菌株阳性；-表示90％以上菌株阴性；d表示11％～89％以上菌株阳性。GB4789.34—20128附录C气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物C.1双歧杆菌培养液制备挑取双歧杆菌琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于PYG液体培养基，同时用未接种菌的PYG液体培养基做空白对照，厌氧，36℃±1℃培养48h。C.2标准液的配制C.2.1乙酸标准溶液准确吸取乙酸5.70mL加水稀释至100.0mL，摇匀，进行标定，配成约1.0mol/L的乙酸标准溶液。标定方法为：准确称取乙酸3g，加水15mL，酚酞指示液2滴，用1mol/mL氢氧化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于60.05mg的乙酸。C.2.2乙酸使用液将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。C.2.3乳酸标准溶液准确吸取含量为85%～90%的乳酸0.84mL，加水稀释至100.0mL，摇匀，配成1.0mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称取乳酸1g，加水50mL，加入1mol/mL氢氧化钠滴定液25mL，煮沸5min，加入酚酞指示液2滴，同时用0.5mol/mL硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于90.08mg的乳酸。C.2.4乳酸使用液将乳酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。C.3方法C.3.1乙酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL～3.0mL放入10mL离心管中，加入0.2mL50％（体积比）硫酸溶液，混匀，加入2.0mL丙酮，混匀后加过量氯化钠，剧烈振摇1min，再加入2.0mL乙醚，振摇1min后，于3000r/min离心5min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用2.0mL丙酮和2.0mL乙醚重复提取2次，合并有机相，于40℃水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至1.0mL，混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。C.3.2乳酸的处理取双歧杆菌培养液2.0mL～3.0mL放入10mL比色管中，100℃水浴10min，加入0.2mL50%（体积比）硫酸溶液，混匀，加入1.0mL甲醇，于58℃水浴30min后加水1.0mL，加三氯甲烷1.0mL，振摇3min，3000r/min离心5min，取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。C.3.3气相色谱条件色谱柱：长2m，内径4mm的玻璃柱，填装涂有20％DNP+7％吐温60（Tween60）的chromosorbwHP（80～100目）；柱温：110℃；汽化室：150℃；检测器：150℃；载气：（N2）50ml/min；进样量1.0µl；外标法峰面积定量。乳酸标准溶液的气相色谱见图C.1，乙酸标准溶液的气相色谱见图C.2。GB4789.34—20129图C.1乳酸标准溶液的气相色谱图C.2乙酸标准溶液的气相色谱C.4结果计算样品培养液中乙酸或乳酸的含量按式（C.1）计算：CAA-A×=标空样X………………………………………………………（C.1）式中：X——样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升（µmol/mL）；A样——样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A空——空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A标——乙酸标准或乳酸标准的峰面积；C——乙酸标准或乳酸标准的浓度，单位为微摩尔每毫升（µmol/mL）。C.5允许差相对相差≤15%。C.6结果判定如果乙酸(µmol/mL)与乳酸(µmol/